前言

免疫熒光技術(shù)是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項(xiàng)技術(shù)，它是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標(biāo)記在抗體（或抗原）上，與其相應(yīng)的抗原（或抗體）結(jié)合后，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應(yīng)。利用熒光顯微鏡可以看見熒光所在的細(xì)胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)和定位，以及利用定量技術(shù)（比如流式細(xì)胞儀）測定含量。

直接法

將標(biāo)記的特異性熒光抗體，直接加在抗原標(biāo)本上，經(jīng)一定的溫度和時(shí)間的染色，用水洗去未參加反應(yīng)的多余熒光抗體，室溫下干燥后封片、鏡檢。

間接法

如檢查未知抗原，先用已知未標(biāo)記的特異抗體與抗原標(biāo)本進(jìn)行反應(yīng)，用水洗去未反應(yīng)的抗體，再用標(biāo)記的抗抗體（第二抗體）與抗原標(biāo)本反應(yīng)，使之形成抗體—抗原—抗體復(fù)合物，再用水洗去未反應(yīng)的標(biāo)記抗體，干燥、封片后鏡檢。如果檢查未知抗體，則表明抗原標(biāo)本是已知的，其它步驟的抗原檢查相同。

標(biāo)記的抗抗體是抗球蛋白抗體，同于血清球蛋白有種的特異性，如免疫抗雞血清球蛋白只對雞的球蛋白發(fā)生反應(yīng)，因此，制備標(biāo)記抗體適用于任何抗原的診斷。

一、實(shí)驗(yàn)步驟

免疫熒光實(shí)驗(yàn)的主要步驟包括 樣片制備、固定及通透（或稱為透化）、封閉、抗體孵育、封片及熒光檢測等。

1、 樣品準(zhǔn)備

對于單層生長細(xì)胞，在傳代培養(yǎng)時(shí)，將細(xì)胞接種到預(yù)先放置有處理過（70%乙醇中浸泡）的蓋玻片的培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞接近長成單層后取出蓋玻片即可，操作過程要小心，防止細(xì)胞脫片。

對于懸浮生長細(xì)胞，有兩種方式，一種是取對數(shù)生長細(xì)胞，制備細(xì)胞片或直接制備細(xì)胞涂片，把細(xì)胞片浸入封閉液中固定，封閉后滴加一抗和二抗孵育；另一種是先在懸浮液中進(jìn)行固定和染色，離心洗脫后，用移液管移至盒式玻片進(jìn)行后續(xù)抗體孵育。

對于冰凍切片制備，建議用新鮮組織，否則組織細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)破壞，易使抗原彌散。組織一定要冷凍適度，切片時(shí)選用干凈鋒利的刀片，防止裂片和脫片。

對于石蠟切片的制備，要*行脫蠟和抗原修復(fù)的處理。

2、固定

做好切片并風(fēng)干后立即用合適的固定液（固定液包括有機(jī)溶劑和交聯(lián)劑，其選擇取決于抗原的性質(zhì)及所用抗體的特性）進(jìn)行固定，尤其要較長時(shí)間保存的白片，一定要及時(shí)固定和適當(dāng)保存。

固定時(shí)間則取決于固定組織切片的大小和類型，對大多數(shù)組織，18-24h即可，而細(xì)胞的固定時(shí)間較短。

3、通透

針對胞內(nèi)抗原，使用0.5% Triton X-100或丙酮等通透劑進(jìn)行通透，這一步的目的是使抗體進(jìn)入胞內(nèi)。

     4、封閉

為防止內(nèi)源性非特異性蛋白抗原的結(jié)合，需要在一抗孵育前先用封閉液（一般包括與二抗同一來源的血清、BSA或者羊血清）封閉，減弱背景著色。封閉開始后，要注意樣品的保濕，避免樣品干燥，否則極易產(chǎn)生較高的背景。

5、一抗孵育

一抗孵育溫度一般分為：4℃、室溫、37℃，其中4℃效果更佳；孵育時(shí)間與溫度、抗體濃度有關(guān)，一般37℃孵育1-2h，4℃過夜（從冰箱拿出后37℃復(fù)溫45min）。具體條件還要根據(jù)樣品、稀釋液等條件進(jìn)行摸索嘗試。

6、熒光二抗孵育

熒光二抗孵育一般在室溫或37℃孵育30min-1h，該過程必須在避光環(huán)境下進(jìn)行，防止熒光淬滅。熒光素標(biāo)記的二抗隨著保存時(shí)間的延長，可能會(huì)有大量的游離熒光素殘留，需要注意配制時(shí)采用小包裝并進(jìn)行適當(dāng)?shù)碾x心。

7、復(fù)染

一般采用DAPI進(jìn)行復(fù)染，目的是形成細(xì)胞輪廓，從而更好地對目標(biāo)蛋白進(jìn)行定位。

8、封片

為了長期保存，我們需要對樣本進(jìn)行封片，用吸水紙吸干爬片上的液體，一般用緩沖甘油等或?qū)ｉT的抗熒光淬滅的封片液。

9、 熒光觀察

有條件的話請立即用熒光顯微鏡觀察拍照，若不能及時(shí)拍照，也要做好封片和封固，保持避光和濕度。熒光顯微鏡的成像能力對最終的結(jié)果也會(huì)造成很大的影響，好的熒光顯微鏡能夠收集熒光信號(hào)，并呈現(xiàn)高分辨率的圖片，使細(xì)節(jié)更清楚，更易得到一張效果好的結(jié)果圖。

注意：

切片清洗：為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色，所以適當(dāng)?shù)丶訌?qiáng)清洗(延長時(shí)間和增多次數(shù))尤為重要，一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均為5次*5min。

(1)單獨(dú)沖洗，防止交叉反應(yīng)造成污染；

(2)溫柔沖洗，防止切片的脫落?？墒褂媒捶绞?；

(3)沖洗的時(shí)間要足夠，才能洗去結(jié)合的物質(zhì)；

(4)PBS的PH和離子強(qiáng)度的使用和要求（建議PH在7.4-7.6，濃度是0.01M；中性及弱堿性條件有利于免疫復(fù)合物的形成，而酸性條件則有利于分解；低離子強(qiáng)度有利于免疫復(fù)合物的形成，而高離子強(qiáng)度則有利于分解）。

根據(jù)上述步驟完成免疫熒光實(shí)驗(yàn)后，就需要進(jìn)行熒光顯微成像，得到我們想要的結(jié)果。選擇一款操作簡單、成像清晰、效果好的熒光顯微鏡進(jìn)行觀察拍照，才能輕松得到更為理想的結(jié)果圖，達(dá)到事半功倍的效果。

Echo Revolve正倒置一體熒光顯微鏡

Echo Revolve正倒置一體熒光顯微鏡作為一款電動(dòng)化、智能化的顯微鏡，具有以下優(yōu)勢：

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