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實時熒光定量PCR擴增是為了得到目的帶擴大濃度進行后續(xù)試驗，單鏈DNA在互補寡聚核苷酸片段的引導(dǎo)下，可以利用DNA聚合酶按5’→3’方向復(fù)制出互補DNA。這時單鏈DNA稱為模板DNA，寡聚核苷酸片段稱為引物，合成的互補DNA稱為產(chǎn)物DNA。雙鏈DNA分子經(jīng)高溫變性后成為兩條單鏈DNA，它們都可作為單鏈模板DNA，在相應(yīng)的引物引導(dǎo)下，用DNA聚合酶復(fù)制出產(chǎn)物DNA。
實時熒光定量PCR擴增使幾個DNA模板分子通過數(shù)小時擴增后增加到百萬倍以上，因此能用微量樣品獲取目的基因，同時也完成了基因在體外的克隆，成為分子生物學(xué)及基因工程中的研究手段。另外在醫(yī)學(xué)研究和醫(yī)療診斷中亦體現(xiàn)出應(yīng)用價值。
PCR的反應(yīng)條件與很多參數(shù)有關(guān)系。如模板濃度，引物長度及GC含量，引物濃度，dNTPs濃度，緩沖液的離子含量，產(chǎn)物大小，變性時間，退火溫度及時間，延長的時間。
物理原因：變性對PCR擴增來說相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時間短，有可能出現(xiàn)假陰性；退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴增效率。
有時還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計，檢測一下擴增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。
如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會成功的。
靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會成功的。
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