植物丙二醛（MDA）檢測試劑盒（TBA比色法）

產(chǎn)品貨號：BA1781

產(chǎn)品規(guī)格：50T/100T

產(chǎn)品簡介：

動(dòng)物或植物細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激(oxidative stress)時(shí)，會發(fā)生脂質(zhì)氧化。丙二醛(Malondialdehyde, MDA)是一種生物體脂質(zhì)氧化的天然產(chǎn)物，一些脂肪酸氧化后逐漸分解為一系列包括 MDA在內(nèi)的復(fù)雜化合物，此時(shí)通過檢測 MDA的水平即可檢測脂質(zhì)氧化的水平，因此MDA的測定被廣泛用作脂質(zhì)氧化的指標(biāo)。生物體內(nèi)的一些其它生化反應(yīng)也會產(chǎn)生MDA，例如thromboxane synthase也可以催化產(chǎn)生，但只要在測定時(shí)設(shè)置適當(dāng)對照即可觀察到脂質(zhì)氧化水平的變化。

植物丙二醛(MDA)檢測試劑盒(TBA比色法)(Plant MDA Assay Kit with TBA)又稱脂質(zhì)氧化(MDA)檢測試劑盒，是采用一種基于MDA和硫代酸(thiobarbituric acid, TBA)反應(yīng)產(chǎn)生紅色產(chǎn)物的顯色反應(yīng)，隨后通過比色法用于對植物組織(根、莖、葉、種子等)MDA進(jìn)行檢測，是專門用于植物脂質(zhì)氧化(lipid peroxidation)水平檢測的試劑盒，不適用于動(dòng)物組織、細(xì)胞、血液等。丙二醛在較高溫度及酸性環(huán)境中可與TBA發(fā)生反應(yīng)，形成紅色的MDA-TBA加合物，MDA-TBA加合物在532nm處有最大吸收，該復(fù)合物的吸光系數(shù)為155mmol/(L.cm)，并且在 600nm波長處有最小吸收。植物組織中糖類物質(zhì)對MDA-TBA反應(yīng)有干擾，我們總結(jié)出經(jīng)驗(yàn)公式，以消除這一干擾。亦可以通過比標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較，進(jìn)行含量檢測。本試劑盒僅用于科研領(lǐng)域，不宜用于臨床診斷或其他用途。

產(chǎn)品組成：

自備材料：

1. 植物根莖、葉子等

2. 剪刀

3. 離心管、小試管或96孔板

4. 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀

5. 水浴鍋或恒溫箱

6. 離心機(jī)

操作步驟（僅供參考）：

1. 樣本處理：

(1) 制備提取液：取適量的植物根、莖、葉子、種子等，稱量后剪碎，按每0.4g植物樣品加入4ml的比例加入組織勻漿液，充分勻漿(一般取0.4～1g植物樣品即可)。4000g離心10min，取上清液待用，該上清液即為MDA提取液。如果采用酶標(biāo)儀檢測結(jié)果，應(yīng)相應(yīng)減少制備提取液的量，譬如取0.2g植物樣品加入2ml組織勻漿液。

(2) 樣品準(zhǔn)備完畢后可以用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，以便于后續(xù)計(jì)算單位蛋白重量植物樣品的MDA含量。測定蛋白濃度非必須步驟，亦可采用經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算。

本試劑盒對于樣品中的常見化學(xué)成分的兼容性參考下表：

2. TBA工作液的配制：稱取適量TBA，用組織勻漿液配制成濃度為0.68％的TBA工作液。例如取0.068g TBA用10ml組織勻漿液配制，最終濃度即為0.68%的TBA工作液。TBA工作液需*溶解后再使用，可以加熱到60℃促溶，并可通過反復(fù)劇烈Vortex促溶。配制好的TBA工作液4℃避光保存，至少1個(gè)月內(nèi)有效。

3. 稀釋標(biāo)準(zhǔn)品：取適量標(biāo)準(zhǔn)品用組織勻漿液稀釋至1、2、5、10、20、50μM；如果進(jìn)行簡易快速檢測，標(biāo)準(zhǔn)品直接稀釋10μM，配制好的MDA標(biāo)準(zhǔn)品4℃避光保存，至少3個(gè)月內(nèi)有效。如果采用經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算含量，無需標(biāo)準(zhǔn)品。

4. 樣品測定:

(1) 分光光度計(jì)測定：在離心管或其它適當(dāng)容器內(nèi)加入1ml組織勻漿液作為空白對照，加入1ml提取液用于測定，隨后加入1ml TBA工作液?？蓞⒖枷卤碓O(shè)置檢測反應(yīng)體系，依次加入試劑：

(2) 酶標(biāo)儀測定：在離心管或其它適當(dāng)容器內(nèi)加入200μl組織勻漿液作為空白對照，加入1ml提取液用于測定，隨后加入1ml TBA工作液?？蓞⒖枷卤碓O(shè)置檢測反應(yīng)體系，依次加入試劑：

(3) 混勻,加蓋，95℃水浴煮沸30min，加熱時(shí)務(wù)必注意避免液體暴沸濺出。如果使用加熱塊(Heat block)進(jìn)行加熱注意用重物壓緊離心管蓋；如果使用沸水浴，則需使用可把蓋子鎖死的離心管或螺旋蓋離心管，或用Parafilm封住離心管口，用針頭刺一小孔。和準(zhǔn)確的加熱方法是使用帶有熱蓋并可以加熱的金屬浴或者0.5mlPCR儀。

(4) 水浴，冷卻至室溫，4000g離心10min。

5. 取上清，蒸餾水調(diào)零，用分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀檢測532nm處吸光值，如果不方便測定532nm的吸光度，也可以測定530-540nm之間的吸光度。如果采用經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算，應(yīng)分別測定450nm、532nm、600nm出吸光度值。

計(jì)算：

對于MDA提取液直接根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算；如果進(jìn)行簡易快速檢測，直接以10μM標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行計(jì)算，獲得 MDA 的摩爾濃度；如果采用經(jīng)驗(yàn)公式，無需制作標(biāo)準(zhǔn)曲線或測定標(biāo)準(zhǔn)品。對于固體狀組織，可以通過單位重量的蛋白含量或組織重量等來表示最初樣品中的MDA含量，例如μmol/mg蛋白或μmol/mg組織。

簡易快速MDA含量計(jì)算公式：

MDA含量(μmol/mg)=(OD測定-OD空白)/(OD標(biāo)準(zhǔn)-OD空白)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度/提取物濃(g/ml)

不采用標(biāo)準(zhǔn)品的經(jīng)驗(yàn)公式：

MDA濃度(μmol/L)=6.45×(OD532-OD600)-0.56×OD450

MDA含量(μmol/mg)=MDA 濃度(μmol/L)×提取液體積(ml)/植物組織鮮重(g)

OD532=待測樣品的532nm處吸光度值

OD600=待測樣品的600nm處吸光度值

OD450=待測樣品的450nm處吸光度值

注意事項(xiàng)：

1. 上述低溫試劑避免反復(fù)凍融，以免失效或效率下降。

2. 待測提取液如不能及時(shí)測定，應(yīng)置于-20℃保存，4天內(nèi)穩(wěn)定。

保存條件： 12個(gè)月有效。4℃運(yùn)輸，4℃保存。