常規(guī)普通PCR常見(jiàn)問(wèn)題

來(lái)源：廣州萊尚生物科技有限公司 2022年07月04日 14:19

1.瓊脂糖凝膠電泳后無(wú)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶

主要表現(xiàn)：Marker及對(duì)照條帶均正常，但檢測(cè)樣本無(wú)條帶。

原因分析：1.反應(yīng)條件不合適：PCR過(guò)程中退火溫度過(guò)高，退火延伸時(shí)間不足，反應(yīng)循環(huán)數(shù)過(guò)少。

2.核酸模板濃度或純度低：普通PCR的檢測(cè)敏感度有限，樣本核酸含量低或者含有抑制物。

3.反應(yīng)體系與核酸擴(kuò)增不匹配：檢測(cè)體系中的Mg2+濃度，dNTPs量或Buffer與目標(biāo)核酸擴(kuò)增所需條件不匹配。

4.引物設(shè)計(jì)不當(dāng)或者發(fā)生降解：存在引物二聚體或二級(jí)結(jié)構(gòu)，引物稀釋后未分裝儲(chǔ)存條件不適宜或者反復(fù)凍融次數(shù)過(guò)多。

解決方案：1.優(yōu)化反應(yīng)條件，梯度摸索退火溫度，延長(zhǎng)退火延伸時(shí)間，增加反應(yīng)循環(huán)數(shù)（30-45區(qū)間為宜）。

2.對(duì)核酸模板進(jìn)行純化，或使用商業(yè)化核酸提取試劑盒進(jìn)行提取，增加核酸模板的上樣量。

3.優(yōu)化反應(yīng)體系（預(yù)混體系除外），改變檢測(cè)體系中的Mg2+濃度及dNTPs用量，更換體系中Buffer。

4.重新設(shè)計(jì)引物，避免引物二聚體和鏈內(nèi)二級(jí)結(jié)構(gòu)，在一次稀釋引物后可分裝成多支小管，減少反復(fù)凍融次數(shù)。

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