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技術指南 | 瓊脂糖凝膠電泳詳解

來源:上海信裕生物科技有限公司   2021年10月26日 16:30  
01

電泳的發(fā)展簡史



1809

國外物理學家Рейсе發(fā)現(xiàn)電泳現(xiàn)象
1909

將膠體離子在電場中的移動稱為電泳
1937

創(chuàng)造了Tiselius電泳儀,建立了研究蛋白的移動界面電泳方法,并證明了血清是由白蛋白及α、β、γ球蛋白組成的。

1948

Wieland和Fischer重新發(fā)展了以濾紙作為支持介質的電泳方法,對氨基酸的分離進行過研究。
1950

Durrum用紙電泳進行了各種蛋白質的分離以后,開創(chuàng)了利用各種固體物質(如各種濾紙、醋酸纖維素薄膜、瓊脂凝膠、淀粉凝膠等)作為支持介質的區(qū)帶電泳方法。
1959

Raymond和Weintraub利用人工合成的凝膠作為支持介質,創(chuàng)建了聚丙烯酰胺凝膠電泳,極大地提高了電泳技術的分辨率,開創(chuàng)了近代電泳的新時代。
02

電泳的基本原理

電泳是指帶電顆粒在電場的作用下發(fā)生遷移的過程。許多重要的生物分子,如氨基酸、多肽、蛋白質、核苷酸、核酸等都具有可電離基團,它們在某個特定的pH值下可以帶正電或負電,在電場的作用下,這些帶電分子會向著與其所帶電荷極性相反的電極方向移動。電泳技術就是利用在電場的作用下,由于待分離樣品中各種分子帶電性質以及分子本身大小、形狀等性質的差異,使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度,從而對樣品進行分離、鑒定或提純的技術。

03

瓊脂糖凝膠電泳

1.瓊脂糖凝膠電泳原理:瓊脂糖凝膠具絡,物質分子通過時到阻力,大分子物質在涌動時受到的阻力大,因此在凝膠電泳中,帶電顆粒的分離不僅取決于凈電荷的性質和數(shù)量,而且還取決于分子大小,這就大大提高了分辨能力。但由于其孔徑相比于蛋白質太大,對大多數(shù)蛋白質來說其分子篩效應微不足道,現(xiàn)廣泛應用于核酸的研究中。瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂糖作支持介質的一種電泳方法。其分析原理與其他支持物電泳最主要區(qū)別是:心兼有“分子篩”和“電泳”的雙重作用。

2.瓊脂糖凝膠電泳用途:用于DNA切膠回收;用于DNA分離;用于佐證DNA是否重組、質粒是否切開以及其他分子生物學研究

3.瓊脂糖凝膠電泳特點:

I、優(yōu)點:

  • 因不含硫酸根和羧基,幾乎消除了瓊脂的電滲

  • 對蛋白質吸附極微,故無拖尾現(xiàn)象。

  • 凝膠結構均勻,孔徑較大,可用來分離酶的復合物、核酸、病毒等大分子物質。

  • 透明度較好,可直接或干燥成薄膜后進行染色。

  • 不吸收紫外光,可直接利用紫外光吸收法作定量測定

  • 有熱可逆性

II、缺點:

  • 機械強度差,易破碎,濃度不能太低。

  • 易被細菌污染,不易保存,臨用前配制。

  • 瓊脂糖支持層上的區(qū)帶易于擴散,電泳后必須立即固定染色。

  • 與PAGE相比,分子篩作用小,區(qū)帶少。

04

瓊脂糖凝膠電泳操作步驟
01
配膠
圖片

1.制備1%瓊脂糖凝膠(大膠用70ml,小膠用50ml):稱取0.7 g(0.5 g)瓊脂糖置于錐形瓶中,加入70 ml(50ml)1×TAE,瓶口倒扣小燒杯.微波爐加熱煮沸3次至瓊脂糖全部融化,搖勻,即成1.0%瓊脂糖凝膠液.

02
制膠板
圖片

取電泳槽內的有機玻璃內槽(制膠槽)洗干凈,晾干,放入制膠玻璃板.取透明膠帶將玻璃板與內槽兩端邊緣封好,形成模子.將內槽置于水平位置,并在固定位置放好梳子.將冷卻到65℃左右的瓊脂糖凝膠液混勻小心地倒入內槽玻璃板上,使膠液緩慢展開,直到整個玻璃板表面形成均勻膠層.室溫下靜置直至凝膠*疑固,垂直輕拔梳子,取下膠帶,將凝膠及內槽放入電泳槽中.添加

03
加樣
圖片

在點樣板或pa rafi lm上混合DNA樣品和上樣緩沖液,上樣緩沖液的最終稀釋倍數(shù)應不小于1X.用10ul微量移液器分別將樣品加入膠板的樣品小槽內,每加完一個樣品,應更換一個加樣頭,以防污染,加樣時勿碰壞樣品孔周圍的凝膠面.(注意:加樣前要先記下加樣的順序).

04
電泳
圖片

加樣后的凝膠板立即通電進行電泳,電壓60-100V,樣品由負極(黑色)向正極(紅色)方向移動.電壓升高,瓊脂糖凝膠的有效分離范圍降低.當溴酚藍移動到距離膠板下沿約1cm處時,停止電泳.


05

影響瓊脂糖凝膠電泳因素
  1. DNA分子的大小

  2. 凝膠的濃度

  3. DNA的構象

  4. 使用的電壓

  5. 瓊脂糖的種類

  6. 電泳緩沖液

  7. 嵌入染料的存在

以上這些因素都會對電泳產(chǎn)生影響,具體詳細內容就不在這里給大家一一介紹了,以后大家遇到什么問題的話,都可以從這幾方面入手去找問題



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