PriCells: MSCs分化為礦化的成骨細(xì)胞                                                                                     

試劑和材料：
1. *培養(yǎng)基（CCM）：α-MEM：α-*基礎(chǔ)培養(yǎng)基，含谷氨酰胺，無核苷酸或脫氧核苷酸；添加：20%附加L-谷氨酰胺 2mmol/L、經(jīng)FBS雜交瘤純化，非熱滅活、青霉素100U/ml、鏈霉素100μg/ml。過濾除菌。儲存于4℃，不超過2周；
2. BDM（骨分化培養(yǎng)基）：CCM包含5mmol/L β-甘油磷酸，50μg/ml抗壞血酸-2-磷酸和1nmol/L地塞米松。過濾除菌；
3. PBSA；
4. 胰蛋白酶/EDTA；
5. 聚丙烯離心管，15ml和50ml；
6. 組織培養(yǎng)皿，6孔，孔面積為9.6cm²；
7. ARS：蒸餾水配制1%ARS，用0.5N氫氧化氨調(diào)節(jié)pH值到4.1，過濾除菌；
8. 福爾馬林緩沖液，10%；
9. 改良的Neubauer血細(xì)胞計(jì)數(shù)器；

實(shí)驗(yàn)方法：
1. 從單層細(xì)胞中收集MSCs；
2. 向6孔培養(yǎng)板的每個(gè)孔中加入2ml CCM，共有1×10⁴個(gè)細(xì)胞（適用于人或大鼠）。最終密度約1×10³個(gè)細(xì)胞/cm²；
3. 將上排3個(gè)孔標(biāo)記為“成骨”，下排3個(gè)孔標(biāo)記為“陰性”；
4. 在37℃，5%CO_²環(huán)境下孵育，每隔兩天更換一次培養(yǎng)基，直到細(xì)胞達(dá)到7.%—80%匯合；
5. 達(dá)到所需的細(xì)胞密度時(shí)，從孔中吸出*樣機(jī)，向6孔培養(yǎng)板上排的孔中加入2ml BDM，向下排的孔中加入2ml CCM；
6. 在37℃，5%CO_²環(huán)境下孵育，每隔兩天更換一次培養(yǎng)基。ARS檢測時(shí)，于21天對細(xì)胞進(jìn)行染色；
（1） 從培養(yǎng)箱中取出分化后的MSC，每孔中的單層細(xì)胞用2ml PBSA潤洗兩次；
（2） 每孔中加入2ml福爾馬林，室溫固定單層細(xì)胞10min；
（3） 吸出福爾馬林，每孔中加入2ml PBSA潤洗兩次后，再用2ml蒸餾水潤洗一次；
（4） 加入2ml ARS溶液，室溫孵育30min；
（5） 過量蒸餾水潤洗各孔，直到“陰性”孔中的背景染色最大限度地清除；
7. 用顯微鏡觀察標(biāo)記為“成骨”的單層細(xì)胞評價(jià)深紅色的程度。成骨分化達(dá)到令人滿意的水平時(shí)，單層細(xì)胞ARS著色面積超過50%。此時(shí)，單層細(xì)胞可在4℃水中最多存放7天?；蛘?，ARS可從著色的單層細(xì)胞中提取出來，用先前描述的方案進(jìn)行測定；