利用Hoechst 33342外流性質(zhì)分選原代角膜間質(zhì)干細(xì)胞
PriCells: 利用Hoechst 33342外流性質(zhì)分選原代角膜間質(zhì)干細(xì)胞
試劑和材料:
1. 2—4代的間質(zhì)細(xì)胞;
2. HBSS/2FB;
3. Hoechst 33342染料,1mg/ml水溶;
4. 碘化丙啶(PI),2mg/ml水溶;
5. 維拉帕米,500μg/ml水溶;
6. DEME/2FB;
7. 胰蛋白酶/TrypLE:TrypLE Express或0.25%胰蛋白酶,溶于CMF-Saline G;
8. MoFlo(或與其類似的)高速細(xì)胞分選儀,具備350nm激發(fā)能力;
實驗方法:
1. 用PriCells原代細(xì)胞分離試劑盒2—4代的間質(zhì)細(xì)胞;
2. 細(xì)胞計數(shù),用DMEM/2FB將細(xì)胞稀釋至1×106/cm2個細(xì)胞/ml;
3. 加入5μg/ml Hoechst 33342染料,37℃,90min,每20min攪動一次;
4. 對照組細(xì)胞在加入Hoechst 33342染料前,先加入50μg/ml維拉帕米孵育20min;
5. 染色后,在4℃環(huán)境下用HBSS/2FB將細(xì)胞洗兩遍并離心,之后在冰上用冷HBSS/2FB重懸細(xì)胞;
6. 于分選前加入2μg/ml PI以鑒別無活性的細(xì)胞;
7. 無菌條件下分選細(xì)胞,高速細(xì)胞分選儀,用350nm激發(fā)。收集藍(lán)色(670nm)和紅色(450nm)熒光均減弱的細(xì)胞。邊群細(xì)胞通過上述步驟與死細(xì)胞和*被染料標(biāo)記的細(xì)胞分離開并被收集起來。對照組要確保用維拉帕米先行孵育后使邊群細(xì)胞消失;
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