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PriCells: 正常人包皮成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)
PriCells: 正常人包皮成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)
實驗材料：
1. 細(xì)胞來源：新生兒包皮；
2. 不含Ca2+和Mg2+的1×PBS，添加200000IU/L青霉素、200mg/L鏈霉素，pH7.2；
3. 0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA溶液：兩者比例為1：1，用D-Hanks液配制；
4. 0.02%大豆胰蛋白酶抑制劑：用DMEM培養(yǎng)液配制；
5. 生長基質(zhì)：人纖維連接蛋白，按10μg/cm2包被培養(yǎng)皿；
6. DMEM培養(yǎng)液：DMEM培養(yǎng)基，加10%胎牛血清、青霉素100IU/ml、鏈霉素100μg/ml；
7. DMF培養(yǎng)液：為無血清化學(xué)限定性培養(yǎng)液?；A(chǔ)培養(yǎng)基為1：1的DMEM和Ham F12混合培養(yǎng)基，加入EGF100ng/ml、胰島素100 ng/ml、轉(zhuǎn)帖蛋白μg/ml、凝血酶1μg/ml、抗壞血酸10μg/ml、氫化可de松5×10-5mol/ml、卵清蛋白1mg/ml和微量元素。添加青霉素100 IU/ml、鏈霉素100μg/ml；
8. 無菌消毒手術(shù)器械、35mm培養(yǎng)皿、三角瓶、100目網(wǎng)篩；
9. 離心管（15ml、50ml）
實驗方法：
1. 分離表皮和真皮；
1） 在無菌條件下取新生兒包皮，用生理鹽水洗凈皮片上的血跡；
2） 將皮片放入盛有0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA溶液的三角瓶中，密封后存放于4℃冰箱中18h；
3） 轉(zhuǎn)移皮片至培養(yǎng)皿中，小心分離表皮層并棄之；
4） 用DMEM清洗真皮片，備用；
2. 制備細(xì)胞懸液；
1） 充分剪碎真皮片，加入膠原酶溶液，于37℃孵育1h；
2） 用吸管反復(fù)吹打組織塊，分散細(xì)胞；
3） 經(jīng)100目篩網(wǎng)過濾消化液，收集濾過的細(xì)胞懸液；
4） 離心細(xì)胞懸液（800r/min，5min），棄上清液；
5） 用DMEM培養(yǎng)液將沉淀的細(xì)胞團制成細(xì)胞懸液；
6） 細(xì)胞計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度；
3. 有血清培養(yǎng)：原代細(xì)胞和傳代后的1—3代細(xì)胞用10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液維持培養(yǎng)；
1） 以5×10-5個/ml的密度將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中。于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每2—3d換液一次；
2） 原代培養(yǎng)至成纖維細(xì)胞匯合成單層后，按常規(guī)方法傳代；
4. 無血清培養(yǎng)：用DMF培養(yǎng)液支持已建立細(xì)胞系的包皮成纖維細(xì)胞的生長和增長；
1）取在含血清條件下已生長匯合成片的培養(yǎng)物，棄培養(yǎng)液。用PBS清洗3次，盡量除去殘留血清；
2）用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA溶液消化分散細(xì)胞。在鏡下觀察到細(xì)胞變圓后，加入大豆胰蛋白酶抑制劑終止消化；
3）加入DMF培養(yǎng)液，用吸管吹打分散細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞密度；
4）取已包被人纖維連接蛋白的35mm培養(yǎng)皿，每皿接種5×104個細(xì)胞。于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每2—3d換液一次；
5）細(xì)胞長滿基質(zhì)表面后，按常規(guī)方法傳代；
PriCells提供：
1. 各種原代細(xì)胞特制基礎(chǔ)培養(yǎng)基；
2. 各種原代細(xì)胞培養(yǎng)特制添加劑；
3. 原代細(xì)胞分離試劑盒；
4. 原代細(xì)胞鑒定試劑盒；
5. 各種原代細(xì)胞DNA；
6. 各種原代細(xì)胞RNA；
7. 各種原代細(xì)胞蛋白質(zhì)；
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