PriCells: 正常大兔膽囊上皮細(xì)胞的培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)材料：

1. 2—3月齡的家兔膽囊；

2. 不含Ca2+和Mg2+的1×PBS，添加200000IU/L青霉素、200mg/L鏈霉素，pH7.2；

3. 培養(yǎng)用液：以DMEM/F12為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加10%的胎牛血清、2 mmol/L谷氨酰胺、2μg/ml胰島素、10 ng/ml表皮生長(zhǎng)因子以及100 IU/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素。酶消化液為0.125%Ⅳ型膠原酶溶液。組織清洗液為DMEM培養(yǎng)液，并添加200 IU/ml青霉素和200μg/ml鏈霉素；也可使用無Ca2+、Mg2+的D-Hanks液作為組織清洗液。

4. 培養(yǎng)器具：用鼠尾膠原或膠原蛋白包被的25ml培養(yǎng)瓶或24孔培養(yǎng)板、無菌普通培養(yǎng)皿若干。手術(shù)刀、眼科剪、鑷等；

實(shí)驗(yàn)方法：

1. 選用2—3月齡的家兔，以戊巴bi妥鈉麻醉，開腹取出肝臟并從中分離膽囊；

2. 排凈膽囊中的膽汁，將膽囊切開，用組織清洗液反復(fù)洗凈膽囊粘膜表面的膽汁和粘液；

3. 在普通培養(yǎng)皿底面滴加1—2ml的酶消化液，膽囊粘膜面朝下，與酶消化液相貼。置37℃下消化10—15min后，再將膽囊移入另一培養(yǎng)皿，粘膜面朝上，向上滴加10%胎牛血清DMEM/F12培養(yǎng)液，以終止消化；

4. 用眼科手術(shù)刀輕刮膽囊粘膜表面，一方面不斷地將培養(yǎng)液滴在粘膜表面，另一方面用吸管收集消化刮落的細(xì)胞；

5. 將收集到的含消化酶的細(xì)胞懸液離心（1000r/min，5—7min）沉淀細(xì)胞，棄上清液。再加培養(yǎng)液將調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至4×104—5×104個(gè)/ml；

6. 直接在培養(yǎng)瓶或板上種植。于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4—7d后，待細(xì)胞貼壁，再每3d更換培養(yǎng)液1次；

7. PriCells-原代上皮細(xì)胞細(xì)胞特制基礎(chǔ)培養(yǎng)基；

8. PriCells-原代上皮細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)特制添加劑；

9. PriCells-原代細(xì)胞分離試劑盒；

10. PriCells-原代細(xì)胞鑒定試劑盒；