基因表達(dá)調(diào)控的方式有很多種，但不外乎在DNA水平、RNA或蛋白質(zhì)水平進(jìn)行調(diào)控。多數(shù)的方式僅能對(duì)基因進(jìn)行高效的、瞬時(shí)的調(diào)控，這在某些應(yīng)用場(chǎng)景下非常有優(yōu)勢(shì)。也可以通過質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、病毒的隨機(jī)整合或同源重組完成穩(wěn)定的和可遺傳的DNA修飾。但是，要實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)特異性的整合是非常耗時(shí)且困難的。隨著的基因組編輯工具不斷被發(fā)現(xiàn)，位點(diǎn)特異性穩(wěn)定修飾變得更容易實(shí)現(xiàn)。

在過去的十年中，鋅指核酸酶（ZFN）和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)核酸酶（TALEN）技術(shù)被確立為位點(diǎn)特異性基因組修飾的有用工具，但隨著近規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列（CRISPR）技術(shù)的出現(xiàn)，它成為了另一種有效的替代方案。

通過基因組編輯靶向修飾細(xì)胞DNA為基礎(chǔ)生物學(xué)研究、早期藥物發(fā)現(xiàn)和新型細(xì)胞療法（例如免疫療法）的開發(fā)提供了強(qiáng)有力的工具。

CRISPR技術(shù)利用工程化核酸酶在靶基因組位置刪除、插入或替換基因（Gaj et al., 2013）。Cas9核酸酶在基因組DNA中產(chǎn)生雙鏈斷裂，從而誘導(dǎo)兩種可能的細(xì)胞修復(fù)過程：1.非同源末端連接（NHEJ）可導(dǎo)致功能基因的缺失，因?yàn)樗陉P(guān)閉斷裂時(shí)通常伴隨突變。2.如果可獲得部分同源供體序列，則可通過同源依賴性修復(fù)（HDR）進(jìn)行基因的插入或替換。為了在特定靶序列上進(jìn)行這種修飾，核酸酶與序列特異性DNA結(jié)合，將核酸酶導(dǎo)向靶序列。

如上所述，對(duì)于基因組編輯，工程化核酸酶用于在靶基因組特定位置刪除，插入或替換基因。這種工程化核酸酶通常由兩個(gè)元件組成：內(nèi)切核酸酶DNA切割模塊和序列特異性DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。核酸酶切割雙鏈DNA，產(chǎn)生雙鏈斷裂（DSB）。DSB誘導(dǎo)細(xì)胞DNA修復(fù)過程。這可能會(huì)發(fā)生兩種類型的修復(fù)過程，1.如果沒有可用的同源供體片段-無論是相應(yīng)的等位基因還是外部供體DNA-斷裂的末端將被重新連接。該過程稱為非同源末端連接（NHEJ），并且通?？赡軐?dǎo)致基因功能元件缺失的突變。

如果存在同源的序列，例如基因組等位基因或外源供體DNA，則可以通過同源重組修復(fù)（HDR）進(jìn)行基因的插入或替換。NHEJ與HDR的頻率取決于實(shí)驗(yàn)設(shè)置，例如細(xì)胞類型和供體量。

這些核酸酶與序列特異性DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的組合可以定制以識(shí)別幾乎任何序列，以位點(diǎn)特異性的方式進(jìn)行基因組編輯。

常用的位點(diǎn)特異性的基因組編輯工具有以下三種：

·   ZFN

·   TALEN

·   CRISPR/Cas9

CRISPR技術(shù)來源于細(xì)菌防御病毒入侵的途徑，目前已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于真核生物的基因組編輯。相較于ZFN和TALEN，它更具有靈活性。

與ZFN和TALEN相比（詳見下文），基于CRISPR的基因組編輯依賴于兩個(gè)獨(dú)立的組件一起工作：

由于DNA特異性部分是RNA分子，因此比ZF-或TALE-核酸酶融合蛋白更容易設(shè)計(jì)和生產(chǎn)。此外，通過將Cas9核酸酶與靶向不同位點(diǎn)的幾種gRNA一起轉(zhuǎn)移，可以進(jìn)行多基因組編輯。

鋅指（ZF）蛋白是自然界中豐富和通用的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Tupler R et al., 2001)。單個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域結(jié)合3個(gè)DNA堿基對(duì)。由于它們的模塊化結(jié)構(gòu)，它們?yōu)樵O(shè)計(jì)人工序列特異性結(jié)合分子提供了理想的框架。ZF與內(nèi)切核酸酶（主要是Fok1）的融合構(gòu)建了鋅指核酸酶（ZFN）。兩種這樣的ZFN組合起作用以結(jié)合靶DNA序列的有義和反義鏈。結(jié)合后，F(xiàn)ok1核酸酶形成活性二聚體并誘導(dǎo)雙鏈斷裂，引起隨后的細(xì)胞修復(fù)過程。

2009年，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)子（TALEs）可作為更簡(jiǎn)單的模塊化DNA識(shí)別蛋白(Boch et al., 2009; Moscou et al., 2009)。TALE是來自植物病原菌屬Xanthomonas天然存在的蛋白質(zhì)，并且含有DNA結(jié)合重復(fù)序列，每個(gè)重復(fù)序列識(shí)別單個(gè)堿基對(duì)。與鋅指的基于三聯(lián)體的DNA結(jié)合相比，TALE-DNA結(jié)合重復(fù)的這種單堿基識(shí)別模式使得設(shè)計(jì)具有更大的靈活性，但也存在一些克隆挑戰(zhàn)。同樣，工程化的TALE通常與Fok1核酸酶融合以構(gòu)建TALE核酸酶融合物（TALEN）。與ZFN一樣，必須為每個(gè)靶標(biāo)產(chǎn)生一對(duì)TALEN，每個(gè)單體結(jié)合(Jinek et al., 2013) 靶DNA的有義或反義鏈。