一文看懂：熒光定量PCR的原理、方法及結(jié)果分析

自從1983年K. Mullis發(fā)明聚合酶鏈式反應(Polymerase chain reaction，PCR)以來，PCR技術(shù)很快成為科研、臨床診斷的熱點技術(shù)。

而實時熒光定量PCR技術(shù)，顧名思義，就是在PCR的基礎(chǔ)上加入熒光基團，通過熒光信號的變化的實時監(jiān)測PCR的反應過程，最后通過對未知模板進行定量分析的方法。

目前，實時熒光定量 PCR 已成為不同樣品間進行基因表達水平定量差異比性方法。在過去十幾年中，該方法迅速流行，涉及科學的多個領(lǐng)域，包括農(nóng)業(yè)、環(huán)境、工業(yè)和醫(yī)學研究。

實時熒光定量PCR的應用

目前，qPCR技術(shù)已經(jīng)廣泛應用于生物醫(yī)藥食品等行業(yè)，應用于疾病的早期診斷、遺傳病的早期診斷、藥物研究、腫瘤的診斷與研究、食品病原微生物的檢測、轉(zhuǎn)基因食品檢測、動物疫病檢測等，除此之外，還包括：

● 基因擴增

● 擴增特異性分析

● 基因定量分析

● 基因檢測

● 基因分型

● SNP分析

● RFLP多態(tài)性分析

● 單/多基因表達研究

● 高通量基因表達譜研究

……

實時熒光定量PCR的常用方法

染料法

熒光染料可與雙鏈DNA結(jié)合，每個循環(huán)的延伸階段，染料摻入雙鏈DNA中，其熒光信號強度與PCR產(chǎn)物的數(shù)量呈正相關(guān)。同時，其缺點也在于其非特異性。當PCR反應中有引物二聚體或者非特異性擴增時，該染料也可以和這些非特異性擴增產(chǎn)物結(jié)合，發(fā)出熒光，從而干擾對特異性產(chǎn)物的準確定量。

常用的染料為SYBR Green I，各公司針對熒光信號強度、抑制作用等進行改進，也推出了很多新的染料供大家選擇。

Promega采用新型熒光染料BRYT Green® Dye，對qPCR反應沒有抑制作用，與雙鏈DNA結(jié)合后熒光信號更強.

探針法

在PCR擴增時加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸：5’端標記一個報告熒光基團，3’端標記一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收;PCR擴增時，Taq酶的5"-3"外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號。

熒光定量PCR結(jié)果分析

一般而言，熒光擴增曲線可以分成三個階段：熒光背景信號階段、熒光信號指數(shù)擴增階段和平臺期。在熒光背景信號階段，擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，無法判斷產(chǎn)物量的變化;在平臺期，擴增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級增加，PCR終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，無法計算起始模板拷貝數(shù)。因此只有在熒光信號指數(shù)擴增階段，PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，故選擇在這個階段進行定量分析。為了定量方便，在實時熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了幾個重要的概念：擴增曲線、熒光閾值、CT值。

(1)擴增曲線

注：

橫坐標：代表擴增循環(huán)數(shù);

縱坐標：代表熒光強度，每個循環(huán)進行一次熒光信號收集。

(2)熒光閾值(Threshold)

在熒光擴增曲線上人為設(shè)定的一個值，它可以設(shè)定在熒光信號指數(shù)擴增階段任意位置上，但一般熒光閾值的設(shè)置是PCR反應前3-15個循環(huán)熒光信號標準偏差的10倍。(如下圖)

(3)CT值

每個反應管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標代表Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。同時，對于熒光PCR實驗來說，CT值也是判讀樣品陰陽性的重要指標。(如下圖)

實驗室應用

PCR檢測方法在臨床醫(yī)學及實驗室檢驗中最有價值的應用領(lǐng)域就是對感染性疾病的診斷。理論上，只要樣本有一個病原體存在，PCR方法就可以檢測到。該方法對病原體的檢測解決了免疫學檢測的“窗口期”問題，常用于疾病的早期診斷，可判斷疾病是否處于隱性或亞臨床狀態(tài)。

大量的熒光定量PCR研究資料表明，病原體數(shù)量與感染性疾病病情的輕重程度、傳染性及治療效果均有相關(guān)性。因此，通過熒光定量PCR方法得到的檢測結(jié)果，一定程度上可以準確反映疾病感染的情況。

除此之外，也可以見于腫瘤分子機制、遺傳病篩查、樣本成分鑒定等多方面的實際應用中。

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