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細(xì)胞凋亡階段Caspase切割核蛋白XRCC4調(diào)節(jié)細(xì)胞膜磷脂結(jié)構(gòu)的改變
細(xì)胞瀕臨死亡時，其細(xì)胞膜中的磷脂分子結(jié)構(gòu)會發(fā)生紊亂，進(jìn)而促進(jìn)磷脂酰絲氨酸的暴露，這是胞吐作用的關(guān)鍵過程。此前研究發(fā)現(xiàn)Xkr家族蛋白Xkr4對于磷脂分子結(jié)構(gòu)的紊亂具有關(guān)鍵的作用，但其激活機制仍然未知。在最近一項研究中，來自日本京都大學(xué)的Jun Suzuki教授等人揭示了Xkr4被激活的兩個步驟：caspase介導(dǎo)的切割形成的二聚體，以及激活因子引起的結(jié)構(gòu)變化。為了確定參與該過程的關(guān)鍵因素，作者使用CRISPR sgRNA文庫開發(fā)了一種新的篩選系統(tǒng)，即“存活篩選”。應(yīng)用該系統(tǒng)，作者確定了核蛋白XRCC4是激活Xkr4的關(guān)鍵分子。當(dāng)細(xì)胞凋亡發(fā)生后，DNA修復(fù)復(fù)合體中所含的XRCC4蛋白被caspase裂解，其C末端片段被釋放到細(xì)胞質(zhì)中，之后該片段與Xkr4二聚體相互作用并導(dǎo)致后者的激活。
此前研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡過程中caspase介導(dǎo)的C-末端切割會導(dǎo)致Xkr4蛋白的激活，而切割反應(yīng)本身并不會導(dǎo)致磷脂酰絲氨酸分子的暴露。為了解釋C末端切割與Xkr4活性之間的關(guān)系，作者首先進(jìn)行了細(xì)胞學(xué)水平的篩選。結(jié)果表明，在表達(dá)全長的Xkr4分子以及caspaseC末端的細(xì)胞中，外界刺激會導(dǎo)致脂質(zhì)結(jié)構(gòu)的紊亂，而該過程依賴于caspase的活性，表明Xkr4的活性不僅依賴caspase本身的切割，同時還需要caspase的其它活性。此外，生化分析表明Xkr4與C末端肽段的二聚化不足以激活其活性。進(jìn)一步，作者通過高通量突變的技術(shù)，篩選得到了若干株能夠穩(wěn)定出現(xiàn)磷脂膜結(jié)構(gòu)紊亂的細(xì)胞克隆，上述克隆中Xkr4分子發(fā)生了一系列突變，導(dǎo)致其活性能夠持續(xù)保持。
（cDNA文庫篩選揭示Xkr4突變對磷脂膜結(jié)構(gòu)的影響）
之后，作者對具備上述活性的Xkr4突變體進(jìn)行了測序分析，發(fā)現(xiàn)了其中存在特定的單點突變，包括I322S, L331F, 或者Q332E。通過分別轉(zhuǎn)染上述突變蛋白并進(jìn)行功能學(xué)與結(jié)構(gòu)學(xué)方面的分析，作者發(fā)現(xiàn)Xkr4的激活依賴兩個獨立的事件：二聚化以及結(jié)構(gòu)變化。
（圖2，Xkr4突變株功能分析及其對磷脂膜結(jié)構(gòu)的影響）
進(jìn)一步，作者試圖探究在自然條件下Xkr4激活的原因。通過高通量的CRISPR-cas9突變篩選，作者發(fā)現(xiàn)了一種叫做XRCC4的蛋白，此前研究表明XRCC4是DNA損傷修復(fù)復(fù)合體的成分，而該研究表明XRCC4蛋白的缺失會顯著影響Xkr4蛋白破壞磷脂膜結(jié)構(gòu)的活性。在此基礎(chǔ)上，作者發(fā)現(xiàn)XRCC4受caspase3的切割而被激活，切割后的XRCC4的C末端能夠從細(xì)胞核向細(xì)胞膜部位轉(zhuǎn)移。在外界促凋亡刺激下，XRCC4能夠調(diào)節(jié)Xkr4的活性，進(jìn)而促進(jìn)磷脂膜的紊亂與磷脂酰絲氨酸的暴露。
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