MB50246.3 v.A

   細(xì)菌P型ATP酶（P type ATPase）活性酶連續(xù)反應(yīng)光度法定量檢測(cè)試劑盒

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)（中文版）

主要用途

   細(xì)菌P型ATP酶（P type ATPase）活性酶連續(xù)反應(yīng)光度法定量檢測(cè)試劑是一種旨在使用P型ATP酶、丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶連續(xù)循環(huán)法反應(yīng)系統(tǒng)，在釩酸鹽存在與否的情況下，受到P型ATP酶的水解產(chǎn)生的ADP過(guò)程中，伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反應(yīng)，即采用光度法測(cè)定其氧化后吸光峰值（NADH濃度）的變化，以此進(jìn)行測(cè)算樣品中酶活性的*而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適合于各種細(xì)菌細(xì)胞P型ATP酶的特異性活性檢測(cè)。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶，嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定，反應(yīng)優(yōu)化，檢測(cè)敏感。

技術(shù)背景

腺苷三磷酸酶，又稱(chēng)為ATP酶（adenosine triphosphatase；ATPase或ATP phosphohydrolase；EC3.6.1.3），屬于磷酸水解酶，可以催化含磷的酸酐分解，即催化三磷酸腺苷分解為二磷酸腺苷和無(wú)機(jī)磷。ATP酶的去磷酸化反應(yīng)釋放出能量，成為細(xì)胞生命代謝的能源。ATP酶為跨膜蛋白（transmembrane），幫助傳輸各種代謝分子進(jìn)出細(xì)胞。根據(jù)ATP酶的結(jié)構(gòu)和功能，分為五類(lèi)不同的ATP酶，即F、V、A、P和E型。P型ATP酶，又稱(chēng)為E1-E2 ATP酶，通常由一條或兩條多肽構(gòu)成，且呈現(xiàn)兩種主要的結(jié)構(gòu)構(gòu)象E1和E2。這類(lèi)ATP酶存在于細(xì)菌和真核細(xì)胞膜和細(xì)胞器上，其功能在于水解ATP獲得能量，跨膜運(yùn)輸各種化學(xué)分子，包括離子和磷脂，例如H⁺、Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Ag⁺、Zn²⁺、Co²⁺、Pb²⁺、Ni²⁺、Cd²⁺、Cu²⁺等。P型ATP酶可以分成三型：I型（細(xì)菌重金屬離子型）、II型（動(dòng)物Na/K、H/K、SERCA、PMCA、真菌和植物HA）、III型（細(xì)菌K）和四種，Ca²⁺傳輸性、Na⁺-K⁺ /H⁺-K⁺傳輸性、H⁺傳輸性和所有細(xì)菌型等。 基于ATP，在P型ATP酶抑制劑釩酸鹽（vanadate）存在與否的情況下，受到P型ATP酶的水解，進(jìn)而通過(guò)丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase；LDH）反應(yīng)系統(tǒng)中，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉(zhuǎn)化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其峰值的變化（340nm），來(lái)定量分析P型ATP酶的特異活性。其反應(yīng)系統(tǒng)為：

產(chǎn)品內(nèi)容

   裂解液（Reagent A）   毫升

   緩沖液（Reagent B）      毫升

   酶促液（Reagent C）           微升

   反應(yīng)液A（Reagent D1）      毫升

   反應(yīng)液B（Reagent D2）      毫升

   底物液（Reagent E） 毫升

   陰性液（Reagent F）   毫升

   專(zhuān)性液（Reagent G）   毫升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)    1份

保存方式

保存   反應(yīng)液B（Reagent D2）在4℃冰箱，其余的在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融；   底物液（Reagent E），避免光照，有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品制備和保存的容器

微型臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品制備

培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)孵育

比色皿：用于光度分析的容器

分光光度儀：用于光度分析

實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液置入冰槽里融化；   底物液（Reagent E）注意避光。然后進(jìn)行下列操作。

• 樣品準(zhǔn)備（總蛋白制備）

• 準(zhǔn)備好10毫升待測(cè)的細(xì)菌放進(jìn)37℃搖床孵育16小時(shí)，速度為220RPM
• 直至OD600＝0.4至0.8，即1至2 X 10⁷細(xì)胞/毫升
• 置于冰槽里5分鐘
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為1000g
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升   裂解液（Reagent A），充分混勻
• 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 強(qiáng)力渦旋震蕩15秒
• 置于冰槽里30分鐘，期間強(qiáng)力渦旋震蕩15秒三次
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為5000g 
• 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用    Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1；使用   裂解液（Reagent A）作為陰性對(duì)照）
• 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

二、測(cè)定準(zhǔn)備

• 準(zhǔn)備好待測(cè)樣品，置于冰槽里 
• 設(shè)定好分光光度儀（溫度為37℃）：波長(zhǎng)為340nm，間隔5分鐘，讀數(shù)7次（共30分鐘），并置零
•    緩沖液（Reagent B）室溫下均衡溫度

• 背景對(duì)照測(cè)定

• 移取xx微升   緩沖液（Reagent B）到新的比色皿
• 加入xx微升   酶促液（Reagent C）
• 加入xx微升   反應(yīng)液A（Reagent D1）
• 加入xx微升   反應(yīng)液B（Reagent D2）
• 加入xx微升   底物液（Reagent E）
• 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
• 加入xx微升   陰性液（Reagent F）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為背景空對(duì)照：340波長(zhǎng)讀數(shù)0分鐘 －340波長(zhǎng)讀數(shù)30分鐘

四、樣品總活性測(cè)定

• 移取xx微升   緩沖液（Reagent B）到新的比色皿
• 加入xx微升   酶促液（Reagent C）
• 加入xx微升   反應(yīng)液A（Reagent D1）
• 加入xx微升   反應(yīng)液B（Reagent D2）
• 加入xx微升   底物液（Reagent E）
• 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
• 加入50微升待測(cè)樣品（注意：100微克總蛋白；樣品須溶解）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品總活性讀數(shù)：340波長(zhǎng)讀數(shù)0分鐘 －340波長(zhǎng)讀數(shù)30分鐘

五、樣品非特異活性測(cè)定

• 移取xx微升   緩沖液（Reagent B）到新的比色皿
• 加入xx微升   酶促液（Reagent C）
• 加入xx微升   專(zhuān)性液（Reagent G）
• 加入xx微升   底物液（Reagent E）
• 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
• 加入50微升待測(cè)樣品（注意：100微克總蛋白；樣品須溶解）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品非特異活性讀數(shù)：340波長(zhǎng)讀數(shù)0分鐘 －340波長(zhǎng)讀數(shù)30分鐘

• 計(jì)算樣品活性

1）樣品活性（總活性和非特異活性）

2）樣品特異活性

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為21次操作（10個(gè)樣本），包括背景對(duì)照測(cè)定
• 操作時(shí)，須戴手套
• 系統(tǒng)操作過(guò)程中，背景測(cè)定只需1次
• 建議使用質(zhì)膜樣品為佳（   細(xì)菌可溶性膜蛋白制備試劑盒—GMS30022.2）
• 建議樣品忌用磷酸緩沖溶液、EDTA、EGTA等，可以使用SUCROSE、IMIDAZOLE等
• 加入樣品啟動(dòng)反應(yīng)后3秒內(nèi)即刻光度測(cè)定
• 反應(yīng)測(cè)定值由高到低變化；測(cè)定可以持續(xù)30分鐘
• 測(cè)定值由高到低變化，即0分鐘測(cè)定讀數(shù)高于10分鐘或30分鐘測(cè)定讀數(shù)，表明有酶活性
• 光度測(cè)定后，比色皿須清洗*
• 建議待測(cè)樣本蛋白濃度為100微克/50微升；如果樣本酶活性過(guò)低或過(guò)高，則可以增加或降低樣本量；注意計(jì)算公式的調(diào)整（本公司提供    Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒GMS30030.1）
• 樣品特異活性是指釩酸鹽敏感的P型ATP酶
• P型ATP酶活性單位濃度定義：在37℃溫度下，pH 7.5條件下，每分鐘內(nèi)能夠氧化1微摩爾還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作為一個(gè)活性單位
• 本公司提供系列ATP酶類(lèi)分析技術(shù)產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)準(zhǔn)確