MB50353.1 v.A

  細(xì)胞逆轉(zhuǎn)錄酶（REVERSE TRANSCRIPTASE）活性熒光定量檢測(cè)試劑盒

產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

  細(xì)胞逆轉(zhuǎn)錄酶（REVERSE TRANSCRIPTASE）活性熒光定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過雙鏈分子底物，在dTTP的參與下，通過逆轉(zhuǎn)錄酶的催化，聚合產(chǎn)生RNA-DNA異源雙鏈DNA分子，由PicoGreen特異染色，即采用熒光法來測(cè)定細(xì)胞裂解樣品中酶活性的*而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種細(xì)胞裂解懸液樣品（動(dòng)物、人體、昆蟲等）逆轉(zhuǎn)錄酶的活性，以及抑制劑檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

逆轉(zhuǎn)錄酶（REVERSE TRANSCRIPTASE；EC2.7.7.49），又稱為RNA依賴性DNA聚合酶（RNA-dependent DNA polymerase），是將單鏈RNA分子轉(zhuǎn)錄為雙鏈DNA的DNA聚合酶，包括HIV逆轉(zhuǎn)錄酶、莫洛尼氏鼠白血病病毒（Moloney murine leukemia virus；MMLV）逆轉(zhuǎn)錄酶、禽類成髓細(xì)胞瘤病毒（avian myeloblastosis virus；AMV）逆轉(zhuǎn)錄酶、端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（telomerase reverse transcriptase） 等。逆轉(zhuǎn)錄病毒使用逆轉(zhuǎn)錄酶達(dá)到逆轉(zhuǎn)錄RNA為DNA，然后整合到宿主基因組再?gòu)?fù)制。在真核生物中，端粒酶是一種逆轉(zhuǎn)錄酶。逆轉(zhuǎn)錄酶在分子生物學(xué)中得到廣泛運(yùn)用。檢測(cè)逆轉(zhuǎn)錄酶活性成為病毒感染的監(jiān)測(cè)手段，同時(shí)作為藥物篩選的靶標(biāo)。基于由poly-A模板與oligo-dT引物構(gòu)成的雙鏈分子底物，在dTTP的參與下，通過逆轉(zhuǎn)錄酶的催化，聚合產(chǎn)生RNA-DNA異源雙鏈DNA分子（heteroduplexes），由PicoGreen特異染色，根據(jù)熒光強(qiáng)度分析（激發(fā)波長(zhǎng)480nm，散發(fā)波長(zhǎng)520nm），來定量測(cè)定逆轉(zhuǎn)錄酶的活性。 

產(chǎn)品內(nèi)容

  清理液（Reagent A） 毫升

  裂解液（Reagent B） 毫升

  緩沖液（Reagent C） 毫升

  底物液（Reagent D） 微升

  終止液（Reagent E） 微升

  染色液（Reagent F） 微升

  稀釋液（Reagent G） 毫升

  標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H） 微升

產(chǎn)品說明書    1份

保存方式

保存  清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里；  染色液（Reagent F）避免光照；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

細(xì)胞刮脫棒：用于細(xì)胞脫離

DOUNCE勻漿器：用于裂解組織

臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品操作

比色皿或酶標(biāo)板：用于熒光分析的容器

熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀：用于熒光分析

實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的  裂解液（Reagent B）置入冰槽里融化。然后進(jìn)行下列操作。

• 樣品準(zhǔn)備

• 準(zhǔn)備好25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶或60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞（1至5 X 10⁶細(xì)胞）
• 小心加入xx毫升  清理液（Reagent A），覆蓋生長(zhǎng)表面
• 小心抽去清理液
• 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞（注意：可以使用胰酶消化）
• 加入xx毫升  清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞
• 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細(xì)胞從這一步驟開始）
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入置于冰槽里的xx微升  裂解液（Reagent B） 
• 強(qiáng)力渦旋震蕩30秒，充分混勻
• 即刻放入預(yù)冷的DOUNCE勻漿器
• 在冰槽里用勻漿棒勻化組織（約80下）
• 將所有組織勻漿物移入15毫升錐形離心管
• 即刻放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g
• 小心移取上清液到新的無(wú)菌的1.5毫升離心管
• 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用   Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－   30030.1）
• 放進(jìn)－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里備用

• 測(cè)定準(zhǔn)備

• 準(zhǔn)備好待測(cè)樣品（例如細(xì)胞裂解萃取液或純化酶樣品等），置于冰槽里
• 設(shè)定好熒光酶標(biāo)儀（溫度為25℃）：激發(fā)波長(zhǎng)490nm，散發(fā)波長(zhǎng)520nm
• 準(zhǔn)備好5個(gè)1.5毫升離心管，標(biāo)記為1至5號(hào)管
• 分別加入xx微升  裂解液（Reagent B）到1至5號(hào)管
• 移取xx微升  標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）到1號(hào)管，混勻
• 小心移取xx微升1號(hào)管稀釋的  標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）到2號(hào)管，混勻
• 小心移取xx微升2號(hào)管稀釋的  標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）到3號(hào)管，混勻
• 小心移取xx微升3號(hào)管稀釋的  標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）到4號(hào)管，混勻
• 將1至5號(hào)管放進(jìn)冰槽里備用；標(biāo)準(zhǔn)管濃度見下表

三、標(biāo)準(zhǔn)曲線構(gòu)建

測(cè)定開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的  染色液（Reagent F）置入冰槽里融化，然后移出2.5微升到新的1.5毫升離心管，加入xx微升  稀釋液（Reagent G），輕柔混勻后，置于冰槽里，標(biāo)記為  反應(yīng)工作液（注意：5次操作量），放在暗室里備用。然后進(jìn)行下列操作

• 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：標(biāo)準(zhǔn)樣品
• 移取xx微升  緩沖液（Reagent C）到96孔板的對(duì)應(yīng)孔里
• 分別加入xx微升  底物液（Reagent D）
• 分別加入5微升上述配制的標(biāo)準(zhǔn)液
• 分別加入xx微升  終止液（Reagent E）
• 分別加入xx微升  染色工作液
• 室溫下孵育5分鐘，避免光照
• 即刻放進(jìn)熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)：獲得相對(duì)熒光讀數(shù)RFU（Relative Fluorescence Unit）
• 實(shí)際熒光讀數(shù)：標(biāo)準(zhǔn)樣品相對(duì)熒光讀數(shù)－5號(hào)管標(biāo)準(zhǔn)樣品相對(duì)熒光讀數(shù)（作為背景空對(duì)照）
• 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：縱座標(biāo)（Y軸）為實(shí)際熒光單位RFU；橫座標(biāo)（X軸）為標(biāo)準(zhǔn)DNA濃度（納克/毫升）

四、樣品測(cè)定

測(cè)定開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的  染色液（Reagent F）置入冰槽里融化，然后移出2.5微升到新的1.5毫升離心管，加入xx微升  稀釋液（Reagent G），輕柔混勻后，置于冰槽里，標(biāo)記為  反應(yīng)工作液（注意：5次操作量），放在暗室里備用。然后進(jìn)行下列操作

• 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：待測(cè)樣品
• 移取xx微升  緩沖液（Reagent C）到96孔板的對(duì)應(yīng)孔里
• 加入xx微升  底物液（Reagent D）
• 加入5微升待測(cè)樣品（注意：10微克純化酶蛋白或50微克裂解懸液蛋白）
• 室溫下孵育60分鐘
• 分別加入xx微升  終止液（Reagent E）
• 分別加入xx微升  染色工作液
• 室溫下孵育5分鐘，避免光照
• 即刻放進(jìn)熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)：獲得相對(duì)熒光讀數(shù)RFU（Relative Fluorescence Unit）
• 實(shí)際熒光讀數(shù)：待測(cè)樣品相對(duì)熒光讀數(shù)－5號(hào)管標(biāo)準(zhǔn)樣品相對(duì)熒光讀數(shù)（作為背景空對(duì)照）
• 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對(duì)應(yīng)DNA濃度（納克/毫升）
• 實(shí)際活性計(jì)算：

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為20次操作
• 操作時(shí)，須戴手套
• 系統(tǒng)操作過程中，標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定只需1次
• 樣品須澄清，至關(guān)重要
• 樣品中避免使用EDTA、EGTA、NaCl、MgCl2、Triton X-100等
• 反應(yīng)完成后即刻進(jìn)行熒光測(cè)定
• 測(cè)定值由低到高變化
• 樣本測(cè)定樣品讀數(shù)高于背景讀數(shù)表明具有酶活性
• 待測(cè)樣本為粗提酶樣品，其蛋白濃度為10微克/5微升；待測(cè)樣本為細(xì)胞裂解懸液，其蛋白濃度為50微克/5微升（本公司提供    Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒   30030.1）
• 如果待測(cè)樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度
• 逆轉(zhuǎn)錄酶單位活性定義為：在25℃，pH 8.1條件下，每小時(shí)內(nèi)能夠轉(zhuǎn)錄1納克DNA所需的酶量作為一個(gè)活性單位
• 本公司提供系列逆轉(zhuǎn)錄酶檢測(cè)試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感