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熒光分光光度計是用于掃描液相熒光標記物所發(fā)出的熒光光譜的一種儀器。其能提供包括激發(fā)光譜、發(fā)射光譜以及熒光強度、量子產(chǎn)率、熒光壽命、熒光偏振等許多物理參數(shù)，從各個角度反映了分子的成鍵和結(jié)構(gòu)情況。通過對這些參數(shù)的測定， 不但可以做一般的定量分析, 而且還可以推斷分子在各種環(huán)境下的構(gòu)象變化， 從而闡明分子結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系。
熒光計結(jié)構(gòu)示意圖
一、激發(fā)光源
對激發(fā)光源主要考慮其穩(wěn)定性和強度，因為光源的穩(wěn)定性直接影響測量的重復(fù)性和準確度，而光源的強度又直接影響測定的靈敏度。熒光測量中常用的光源包括高壓汞燈或氙燈。氙燈產(chǎn)生強烈的連續(xù)輻射，其波長范圍在250~700nm；高壓汞燈發(fā)射365 nm、405 nm、436 nm、546 nm、579 nm、690nm和734 nm的線狀譜線，測量中常用365 nm、405 nm、436 nm三條譜線。目前大部分熒光分光光度計都采用150W和500W的氙燈作光源；現(xiàn)代熒光儀器有采用12 V50W的新型溴鎢燈作光源，在300~700nm波段發(fā)射連續(xù)光譜。此外，20世紀70年代開始用激光作為激發(fā)光源，激光光源單色性好、光強度大、脈沖激光的光照時間短，可以避免某些感光物質(zhì)的分解。
二、單色器
熒光分析儀器有兩個單色器，激發(fā)單色器和熒光單色器)。單色器的作用是將不需要的光除去，使需要的激發(fā)光透過而照射到樣品池，第二個濾光片將由激發(fā)光所發(fā)生的反射光、瑞利散射光、拉曼散射光和由溶液中雜質(zhì)所發(fā)生大多數(shù)的熒光濾去。濾光片熒光計采用濾光片做單色器，結(jié)構(gòu)簡單，價格便宜，用于已知組分樣品的定量分析，不能提供激發(fā)光譜或熒光光譜。熒光分光光度計都采用光柵分光，可以獲得單色性好的激發(fā)光，并能分出某一波長的熒光，以減少干擾，而且可以掃描激發(fā)光譜或熒光光譜。
三、樣品池
熒光分析用的樣品池須用低熒光材料制成，通常用石英，四面均透光。形狀有正方形、長方形或圓形，但常用正方形樣品池，因其散射干擾較少。
四、檢測器
熒光分光光度計中的檢測器有較高的靈敏度，一般用光電倍增管(PMT)做檢測器。為了消除激發(fā)光對熒光測量的干擾，在儀器中，檢測光路與激發(fā)光路是相互垂直的。
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