實驗發(fā)現(xiàn)，使用Gibco CTS Dynabeads CD3/CD28磁珠可以使初始和早期記憶T細胞幾乎100%恢復。這種同時進行T細胞分離和活化的一步法能夠產(chǎn)生純凈且被均勻活化的T細胞。用CTS Dynabeads CD3/CD28擴增的CD4+和CD8+ T細胞在第10天維持早期記憶表型并且具有克隆多樣性。早期去除磁珠是可行的并且提高γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒的轉(zhuǎn)導效率。CTS Dynabeads CD3/CD28磁珠可提供可靠的結(jié)果，已用于80多種臨床試驗和商業(yè)T細胞藥物生產(chǎn)中。

實驗方法:

1. 使用CTS Dynabeads CD3/CD28(磁珠:細胞比例為3:1)在細胞培養(yǎng)袋中分離并激活來自健康供體的PBMC的T細胞，其中CTS OpTmizer T細胞擴增SFM補充有CTS免疫細胞血清替代物，Gibco™ L-谷氨酰胺和Gibco™慶大霉素(不*培養(yǎng)基)。
2. 在移除磁珠后，在細胞培養(yǎng)板或者細胞培養(yǎng)袋中擴增T細胞。
3. 將分離的和活化的T細胞在*培養(yǎng)基(不*培養(yǎng)基加100U/mL IL-2)中擴增7–10天；在刺激后第2，3或5天磁性移除CTS Dynabeads CD3/CD28。
4. 用涂有重組人纖維蛋白試劑的微孔板中的編碼EGFP的γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導T細胞。
5. 使用流式細胞分析軟件在細胞分析儀上進行T細胞的流式細胞術(shù)分析。
6. 使用Invitrogen™ Dynabeads™ mRNA DIRECT™純化試劑盒分離來自T細胞的RNA，并使用Ion AmpliSeq™試劑盒通過TCRβ測序?qū)ζ溥M行分析。

實驗結(jié)果

CTS Dynabeads CD3/CD28磁珠不需要上游T細胞選擇，因為該技術(shù)基于CD3和CD28共表達同時分離和激活初始和早期記憶T細胞。流式細胞術(shù)分析顯示CD3+ CD28+ T細胞被分離，恢復率高(>90%)(圖2)。在激活后第3天，細胞被均勻刺激(>95% CD25+)并具有高純度(>95% CD3+)(圖3)。

（CTS Dynabeads CD3/CD28優(yōu)先分離CD3+ CD28+ 細胞。將PBMC與CTS Dynabeads CD3/CD28以3:1磁珠:細胞的比例孵育30分鐘，并分析陰性(非分離)級分并用于計算分離效率。A代表性細胞圖，證明CD3+ CD28+ T細胞分離的效率。B恢復實驗總結(jié)(n = 9)。）

（用CTS Dynabeads CD3/CD28分離的T細胞被均勻刺激且具有高純度。(A，B)在分析活化標記物之前，將分離的T細胞擴增3天。(C，D)在第0天(起始材料)和激活后第3天和第10天分析T細胞純度。）

（T細胞擴增后克隆多樣性增加。用CTS Dynabeads CD3/CD28分離并活化T細胞。(A)在第0，3和10天，收獲樣品用于TCRβ測序。(B)在一個實驗中，在激活后第3天也用γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導T細胞。）

實驗結(jié)論

• CTS Dynabeads CD3/CD28分離CD3+ CD28+ T細胞，效率高，純度高。
• 分離和活化的CD4+和CD8+ T細胞在10天內(nèi)擴增100至800倍，同時保留年輕表型(CD45RA+/- CD127+/- CD62L+ PD-1-)。
• 基于TCRβ測序，擴增的T細胞具有增加的克隆多樣性。
• 第2天去除磁珠提高了γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒的轉(zhuǎn)導效率。

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品牌                            貨號                                     名稱

Gibco™                    40203D              CTS™ (Cell Therapy Systems) Dynabeads™ CD3/CD28

Gibco™                    11161D                Dynabeads™ Human T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansion and Activation

BioGems                 05121-25             Anti-Human CD3 SAFIRE Purified