細(xì)菌蛋白抽提試劑盒說明書

Bacterial Protein Extraction Kit

目錄號：K0888

保存條件：Lysozyme、DNaseⅠ、蛋白酶抑制劑混合物-20℃保存，其他組分室溫保存。

組分說明

Cat. No.     K0888    K0888A

Size         25 次     100 次

Bacterial Protein Extraction Reagent 25 ml 100 ml

蛋白酶抑制劑混合物   250 μl     1 ml

Lysozyme （50 mg/ml）   50 μl     200 μl

DNaseⅠ（1,000 U/ml）   25 μl     100 μl

產(chǎn)品簡介

　　細(xì)菌蛋白抽提試劑使用溫和的非離子型去污劑，適用于大腸桿菌表達(dá)的重組蛋白及

轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞的蛋白提取。提取過程中不需進(jìn)行超聲破碎，有效避免了外源蛋白的污

染。細(xì)菌蛋白抽提試劑盒在抽提試劑的基礎(chǔ)上添加了溶菌酶、DNase I和蛋白酶抑制劑混

合物，可提高蛋白提取效率并減輕因DNA引起的粘稠現(xiàn)象，有效避免蛋白降解。所提取

的蛋白保持了生物學(xué)活性，可進(jìn)行IP，Western Blot，蛋白純化等下游操作。

注意事項

1．細(xì)菌蛋白抽提試劑適用于從新鮮或凍存細(xì)菌中提取蛋白，也適用于從桿狀病毒轉(zhuǎn)染

   的昆蟲細(xì)胞中提取蛋白。

2．本品采用Tris緩沖系統(tǒng)，蛋白提取后的純化操作，請使用相同的緩沖系統(tǒng)。

3．使用本產(chǎn)品獲得的蛋白裂解液，可用BCA或Bradford法進(jìn)行蛋白定量。

4．使用本產(chǎn)品從一系列常見的宿主菌中抽提可溶性蛋白，均有較好的提取效果。對于

   特殊的菌株，如果抽提效果不理想，可在抽提蛋白前冰凍細(xì)胞。

5．根據(jù)具體情況，可在本產(chǎn)品中加入蛋白酶抑制劑、鹽、螯合劑、還原劑。

                本產(chǎn)品僅供科研使用，請勿用于臨床診斷及其他用途

操作步驟

       ●  昆蟲細(xì)胞蛋白提取

     1．低速離心收集細(xì)胞。

     2．稱量細(xì)胞濕重，按10 ml/g的量加入細(xì)菌蛋白抽提試劑。

     3．重懸后，冰上孵育20分鐘（冰上放置時間應(yīng)根據(jù)細(xì)胞類型不同進(jìn)行調(diào)整）。

     4．15,000×g離心15分鐘，分離可溶性蛋白。

       ●  細(xì)菌可溶性蛋白提取

     1．5,000×g離心10分鐘，收集菌體。

     2．可選步驟：每1 ml 細(xì)菌抽提試劑中加入1 μl DNase I（1,000 U/ml）、2 μl Lysozyme

        （50 mg/ml）和10 μl蛋白酶抑制劑混合物，渦旋震蕩混勻。

     3．按照每克菌體沉淀加入20 ml細(xì)菌蛋白抽提試劑的比例 ，即按照1:20的比例，向菌體沉淀中加入抽提液，充分渦旋或用移液器上下吹打直至菌體*重懸。

     4．重懸后，室溫孵育10-15分鐘（放置時間應(yīng)根據(jù)細(xì)胞類型不同進(jìn)行調(diào)整）。

     5．15,000×g離心5分鐘。

     6．轉(zhuǎn)移上清至新的離心管中（上清中即為可溶性蛋白），進(jìn)行蛋白定量及下游實驗。

        注意：如過表達(dá)的大部分蛋白仍在沉淀中，目的蛋白可能以包涵體形式存在，可使用包涵體蛋白溶解液（K0007）進(jìn)行溶解或優(yōu)化表達(dá)條件增加可溶性蛋白的表達(dá)。

   常見問題：

1. 目的蛋白不溶

可能原因：目的蛋白表達(dá)為包涵體

解決方法：優(yōu)化表達(dá)條件或使用包涵體蛋白溶解液,在蛋白抽提試劑中加入Lysozyme  和  DNase I

2. 加入Lysozyme 后目的蛋白仍沒有提取出來

可能原因:溫度過低,Lysozyme活性降低或失活

解決方法：將使用試劑恢復(fù)至室溫,加入更多的Lysozyme或更換新的酶

3. 提取物粘度高

可能原因：DNase I 活性降低或失活

解決方法：a加入更多的DNase I 或更換新的DNase I

         b將鎂離子的終濃度增加至2mM

4. 蛋白抽提后仍有大部分蛋白存在于沉淀中

可能原因：蛋白量過大

解決方法：加入Lysozyme及DNase I

5. 蛋白抽提試劑有沉底析出

可能原因：溫度過低

解決方法：將蛋白抽提試劑恢復(fù)至室溫

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