在一項新的研究中，高彩霞教授課題組基于截短的人APOBEC3胞嘧啶脫氨酶（A3Bctd）構(gòu)建出兩種新的CBE，并開發(fā)出一種高通量檢測方法，用于評估植物CBE中不依賴于單向?qū)NA（sgRNA）的脫氨變化。
 

他們首先開發(fā)了一種快速、高通量且廉價的方法---nSaCas9介導(dǎo)的正交R環(huán)測定法---來評估植物中的CBE。在這種測定法中，正交CRISPR系統(tǒng)nSaCas9被用于在植物細(xì)胞中產(chǎn)生單鏈DNA（ssDNA）區(qū)域，作為不依賴于sgRNA的脫氨變化的靶標(biāo)。為了評估nSaCas9介導(dǎo)的正交R環(huán)測定，他們將它與全基因組測序（WGS）測定進(jìn)行了比較。

一致性的結(jié)果表明，nSaCas9介導(dǎo)的正交R-loop測定法為評估CBE的不依賴于sgRNA的脫靶活性提供了一種合理、快速和高通量的方法。

他們隨后通過合理設(shè)計構(gòu)建出16個A3Bctd脫氨酶變體，并評估了它們的在靶效率（on-target efficiency）和不依賴于sgRNA的脫靶活性。他們利用nSaCas9介導(dǎo)的正交R環(huán)測定法對這些A3Bctd-BE3變體進(jìn)行了測試，并選擇了7個與高效的在靶編輯活性和下降的脫靶活性相關(guān)的突變。之后，他們將這些突變進(jìn)行組合，產(chǎn)生了9個新的具有雙氨基酸或三氨基酸替換的A3Bctd-BE3變體。

通過這種方式，他們得到了兩個新的CBE變體：A3Bctd-VHM-BE3和A3Bctd-KKR-BE3，這兩個變體表現(xiàn)出高效的在靶活性和明顯下降的不依賴于sgRNA的脫靶活性。

此外，這兩種新的CBE變體在它們的靶位點上的編輯表現(xiàn)得更，主要產(chǎn)生單個和兩個胞嘧啶（C）編輯。他們還通過全基因組測序驗證了A3Bctd-VHM-BE3和A3Bctd-KKR-BE3的高特異性