MB50308.3 v.A

 血液血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化酶2（ACE2）活性比色法定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書

（中文版）

主要用途

 血液血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化酶2（ACE2）活性比色法定量檢測試劑是一種旨在通過三肽化合物底物FAPGG，在血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化酶1抑制劑的存在下，受到血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化酶2的水解，釋放出FAP，產(chǎn)生吸收峰值的變化，即采用比色法來測定樣品中酶活性的*而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種動物和人體血液樣品（血漿、血清、紅細胞等）血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化酶2（ACE2）的特異活性檢測，以及抑制劑和激活劑的篩選。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，具有高通量、自動化操作的優(yōu)點。

技術(shù)背景

血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化酶（angiotensin I-converting enzyme；ACE；EC3.4.15.1），又稱為肽基二肽酶A（peptidyl dipeptidase A）、羧基組織蛋白酶（carboxycathepsin）或激肽酶II（kininase II），是一種體細胞類150至180KD、生殖細胞類90至110KD的多肽外切酶（exopeptidase）和鋅金屬肽酶（zinc metallopeptidase）。血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化酶有2種同工酶：1型和2型，其間80至90%同源。I型主要存在于肺毛細管細胞內(nèi)，也在血管內(nèi)皮細胞、腎上皮細胞和睪丸leydig細胞膜中表達；II型主要存在于心臟和腎臟血管內(nèi)皮細胞膜上。ACE在腎素-血管緊張素-醛固酮（aldosterone）系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。作為血管收縮劑（vasoconstrictor），ACE催化十肽血管緊張素I的C末端的組胺酰亮氨酸（histidylleucine）二肽的切離水解反應(yīng)，轉(zhuǎn)化為血管緊張素II；同時作為血管擴張劑（vasodilator），ACE使緩激肽（bradykinin）失活。ACE常用于藥物靶標(biāo)，治療高血壓（例如噻嗪化物thiazide）、心力衰竭（例如利尿靈furosemide）、糖尿病腎病和SARS等疾患。基于人工合成的三肽化合物底物呋喃基丙烯酰苯丙氨酰甘氨酰甘氨酸（N-[3-(2-furyl)acryloyl]-L-phenylalanylglycylglycine；FAPGG），在血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化酶1抑制劑甲羥孕酮醋酸酯（Foroxymithine）的存在下，受到血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化酶2的水解，釋放出呋喃基丙烯酰苯丙氨酸（furylacryloylphenylalanine；FAP）和雙甘氨肽（glycylglycine），產(chǎn)生吸收峰值的變化，在分光光度儀（340nm 波長）下，來定量測定血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化酶2的特異活性。血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化酶2反應(yīng)系統(tǒng)為：

產(chǎn)品內(nèi)容

 清理液（Reagent A） 毫升

 裂解液（Reagent B） 毫升

 緩沖液（Reagent C） 毫升

 陰性液（Reagent D）   毫升

 底物液（Reagent E）   毫升

產(chǎn)品說明書    1份

保存方式

保存 清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在-20℃冰箱里； 底物液（Reagent E）避免光照和反復(fù)凍融；有效保證6月

用戶自備

抗凝管：用于血液收集的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

（微型）臺式離心機：用于樣品操作

培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)物孵育

酶標(biāo)板或比色皿：用于樣品比色測定的容器

酶標(biāo)儀或分光光度儀：用于樣品比色分析

實驗步驟

• 樣品制備

選擇一：血漿樣品

• 準(zhǔn)備好ACD抗凝管
• 抽取1毫升血液，置于抗凝管里
• 放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為700g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取上層黃色液體到新的1.5毫升離心管――此為血漿成分（注意：避免觸碰白色液體層）
• 即刻置于冰槽里備用或放進－70℃冰箱里保存
• （選擇步驟）移取10微升進行蛋白定量測定 （注意：建議使用  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）

選擇二：血清樣品

1． 準(zhǔn)備好不含抗凝劑的儲存管 

• 抽取1毫升血液，置于儲存管里
• 室溫下，靜置30分鐘，直至血液凝結(jié)
• 放進4℃微型臺式離心機離心15分鐘，速度為2000g（或5000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取上層黃色液體到新的1.5毫升離心管――此為血清成分（注意：避免觸碰白色液體層）
• 即刻置于冰槽里備用或放進－70℃冰箱里保存
• （選擇步驟）移取10微升進行蛋白定量測定 （注意：建議使用  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）

選擇三：紅細胞樣品

• 準(zhǔn)備好ACD抗凝管
• 抽取1毫升血液，置于抗凝管里
• 轉(zhuǎn)移到15毫升錐形離心管
• 放進4℃臺式離心機離心30分鐘，速度為200g（或1000RPM，例如eppendorf 5815）
• 小心抽去上清液
• 加入xx毫升 清理液（Reagent A），混勻
• 放進4℃臺式離心機離心7分鐘，速度為1200g（或2500RPM，例如eppendorf 5815）
• 小心抽去上清液
• 重復(fù)實驗步驟6至8二次
• 加入xx毫升預(yù)冷的 裂解液（Reagent B）
• 渦旋震蕩15秒
• 放進4℃臺式離心機離心7分鐘，速度為1200g（或2500RPM，例如eppendorf 5815）
• 小心移取上清液到新的15毫升離心管
• 即刻置于冰槽里備用或放進－70℃冰箱里保存
• （選擇步驟）移取10微升進行蛋白定量測定 （注意：建議使用  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）

• 測定準(zhǔn)備

• 準(zhǔn)備好藥物處理的待測樣品
• 設(shè)定好酶標(biāo)儀（溫度為37℃）：波長340nm，間隔5分鐘，讀數(shù)6次（共30分鐘），并置零或0分鐘和30分鐘各測讀1次，并置零
• 實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的 底物液（Reagent E）置入冰槽里融化，避免光照

• 活性測定

• 在96孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對照和樣品
• 分別移取xx微升 緩沖液（Reagent C）到相應(yīng)孔中
• 分別加入xx微升 底物液（Reagent E）
• 輕輕搖動96孔酶標(biāo)板
• 在37℃溫度下孵育15分鐘
• 分別加入xx微升 陰性液（Reagent D）或上述制備的待測樣品（100微克蛋白）到相應(yīng)孔中（注意：樣品須清澈）
• 輕輕搖動96孔酶標(biāo)板（限定在10秒之內(nèi)）
• 即刻放進37℃預(yù)熱的酶標(biāo)儀檢測或轉(zhuǎn)移到200微升比色皿，在分光光度儀里檢測
• 獲得吸光讀數(shù)：0分鐘讀數(shù)－30分鐘讀數(shù)
• 活性計算：

• 酶標(biāo)儀檢測

• 比色皿檢測

注意事項

• 本產(chǎn)品為20次操作，包括背景對照
• 操作時，須戴手套
• 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次
• 樣品須澄清，且避免反復(fù)凍融
• 樣品避免使用EDTA和EGTA等處理
• 加樣后10秒內(nèi)比色測定
• 測定值由高到低變化；測定持續(xù)30分鐘
• 比色測定后，比色皿須清洗*
• 樣品0分鐘讀數(shù)通常和背景空對照0分鐘讀數(shù)一致，約為1.5左右
• 樣本測定30分鐘讀數(shù)低于0分鐘讀數(shù)，即讀數(shù)下降，表明具有酶活性
• 建議待測樣本蛋白濃度為100微克/20微升；如果樣本酶活性過低或過高，則可以增加或降低樣本量（本公司提供   Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒GMS30030.1）
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度
• 可以使用血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化酶2抑制劑DX600（IC50=10微摩爾）作為抑制劑對照或陰性對照
• 血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化酶2單位活性定義為：在37℃，pH 8.3條件下，每分鐘內(nèi)能夠產(chǎn)生1微摩爾呋喃基丙烯酰苯丙氨酸（Furylacryloylphenylalanine）所需的酶量作為一個活性單位
• 本公司提供系列血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化酶學(xué)檢測試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感