干貨分享|熱啟動(dòng)酶耐熱機(jī)制全面解析

常規(guī)PCR技術(shù)因能夠快速擴(kuò)增任何已知的DNA///片段而被廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。但常規(guī)型PCR技術(shù)容易出現(xiàn)引物二聚體或錯(cuò)配引起的非特異性擴(kuò)增等現(xiàn)象，造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不準(zhǔn)確性。熱啟動(dòng)型PCR能夠很好的解決上述問題，是常用的提高PCR特異性的方法。

熱啟動(dòng)酶介紹

熱啟動(dòng)酶（Hot start enzyme）主要利用酶的修飾物在常溫下抑制DNA聚合酶的活性，加熱至變性溫度時(shí)修飾物失活，釋放酶活，從而使PCR反應(yīng)得以正常進(jìn)行。目前市面上常用的DNA聚合酶熱啟動(dòng)修飾方法主要有化學(xué)修飾、配體修飾和抗體修飾等，不同的熱啟動(dòng)修飾方法原理上有所區(qū)別，各有優(yōu)劣勢。

化學(xué)法

DNA聚合酶的化學(xué)法修飾，一般采用化學(xué)小分子如酸酐等有機(jī)物與聚合酶上的側(cè)鏈氨基酸（賴氨酸）通過化學(xué)反應(yīng)相互作用，使酶低溫時(shí)失去酶活，溫度升高后，酸酐與氨基之間的化學(xué)鍵斷裂，酶活釋放，從而達(dá)到熱啟動(dòng)效果。化學(xué)修飾可有效封閉酶的活性，操作簡單，但酶活性釋放速度較慢，依賴溫度激活DNA聚合酶，能有效抑制非特異性產(chǎn)物，可在室溫下配置反應(yīng)體系，且對(duì)PCR反應(yīng)buffer要求較高。

圖1：化學(xué)法修飾熱啟動(dòng)酶原理圖

配體法

配體法修飾，主要借助核酸適配體封閉酶活。顧名思義，核酸適配體一般指一類具有特異性識(shí)別功能的單鏈核酸分子，可以是RNA也可以是DNA，長度一般為25～60個(gè)核苷酸。作為一種寡核甘酸序列的識(shí)別分子，作用的靶分子范圍廣泛，從無機(jī)金屬的小分子到生物領(lǐng)域的大分子。這些適配子可以形成特定的空間構(gòu)象，從而在表觀功能上與抗體類似。對(duì)蛋白質(zhì)或其他小分子物質(zhì)具有高度特異性、親和力。核酸適配體通過非共價(jià)鍵與DNA聚合酶結(jié)合，進(jìn)而抑制聚合酶在非許可溫度下的聚合反應(yīng)。一般核酸適配體的篩選所需周期較短，整個(gè)過程能夠依賴自動(dòng)化，簡便快捷。

圖2：配體法修飾熱啟動(dòng)酶原理圖

抗體法

抗體法熱啟動(dòng)酶一般考慮使用DNA聚合酶抗體封閉酶活性，使其在低溫時(shí)處于無活性狀態(tài)，在加熱至變性溫度時(shí)抗體變性，解除封閉從而釋放活性，可以大大避免錯(cuò)配或引物二聚體引起的非特異性擴(kuò)增。另一方面針對(duì)低豐度基因，封閉抗體在避免預(yù)變性前的DNA聚合酶和模板的非特異性結(jié)合的同時(shí)，增加了引物與微量的正確模板碰撞退火的效率，從而保證低豐度基因的有效檢出，大大提升反應(yīng)靈敏度和擴(kuò)增效率。

圖3：抗體法修飾熱啟動(dòng)酶原理圖

表1：熱啟動(dòng)酶常見修飾方法優(yōu)劣勢比較

以上簡單介紹了熱啟動(dòng)酶的常見類別和各種熱啟動(dòng)方法的優(yōu)劣勢，其中化學(xué)修飾物不能夠批量合成，而且需要較長的激活時(shí)間聚合酶才能釋放酶活。配體修飾DNA聚合酶只在20-25°C效果較好，到40°C時(shí)，聚合酶的活性就被釋放出來，特異性不好；而抗體法修飾熱啟動(dòng)酶對(duì)應(yīng)的封閉效果佳，酶活釋放速度快，從而大大降低PCR反應(yīng)時(shí)間，是目前IVD市場上應(yīng)用較多的一種熱啟動(dòng)酶改造方法。

熱啟動(dòng)酶應(yīng)用

熱啟動(dòng)酶在熱啟動(dòng)PCR的應(yīng)用方面較為廣泛，不僅有效防止非特異性PCR產(chǎn)物，而且在較難擴(kuò)增的PCR反應(yīng)如單拷貝基因的擴(kuò)增、多重PCR和超長片段的擴(kuò)增等應(yīng)用尤為突出，大大改觀了傳統(tǒng)PCR技術(shù)的局限性。在病原微生物檢測、遺傳病診斷和法醫(yī)鑒定等各個(gè)領(lǐng)域等實(shí)際應(yīng)用中頗為廣泛。在應(yīng)對(duì)爆發(fā)的新guan疫情方面，熱啟動(dòng)酶亦貢獻(xiàn)頗多。目前市面上應(yīng)用于SARS-Cov-2的一步法RT-qPCR檢測試劑的核心酶基本都是抗體法熱啟動(dòng)酶。

相關(guān)產(chǎn)品

參考文獻(xiàn)

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