MB50018.1.1 v.A

 細(xì)胞脊髓過氧化酶（MPO）活性比色法定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

 細(xì)胞脊髓過氧化酶（MPO）活性比色法定量檢測試劑是一種旨在通過脊髓過氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)中底物還原性愈創(chuàng)木酚，經(jīng)過過氧化反應(yīng)后，產(chǎn)生的吸光值變化，即采用比色法來測定細(xì)胞樣品中酶活性的*而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種動物或人體細(xì)胞裂解萃取樣品脊髓過氧化酶（MPO）的總活性檢測。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

脊髓過氧化酶（myeloperoxidase；MPO；EC1.11.1.7）是一種高度陽離子糖基化血紅素蛋白（hemeprotein），由兩個雙體通過二硫鍵連接在一起。每個雙體由一個重鏈亞體（53kd）和一個輕鏈亞體（15kd）構(gòu)成。其總分子量為144kd。脊髓過氧化酶存在于多形核白細(xì)胞的嗜天青顆粒（azurophilic granule）中，尤其在中性白細(xì)胞和單核細(xì)胞中。脊髓過氧化酶通過使用過氧化氫，氧化芳香類化合物，產(chǎn)生自由基，達(dá)到抗菌作用。脊髓過氧化酶可以催化氯離子的過氧化作用，生成非自由基次綠酸（hypochlorite）。脊髓過氧化酶參與機體的天然防御機制，但是一旦失控，則會產(chǎn)生組織損害和炎癥反應(yīng)。脊髓過氧化酶的活性檢測可以用來評價和診斷心血管疾病狀況?；诘?/span>物還原性愈創(chuàng)木酚（guaiacol或2-o-methoxyphenol），作為氫的供體，在過氧化氫的參與下，受到脊髓過氧化酶的過氧化催化，成為氧化性愈創(chuàng)木酚，而發(fā)生吸光值的增高（470nm波長），來定量測定脊髓過氧化酶的活性。脊髓過氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)為：

myeloperoxidase

2 （reduced guaiacol） +  H2O2       →      2 （oxidized guaiacol）  +  2H2O

產(chǎn)品內(nèi)容

 清理液（Reagent A） 120毫升

 裂解液（Reagent B）  10毫升

 緩沖液（Reagent C）  20毫升

 底物液（Reagent D）   1毫升

 氧化液（Reagent E）   1毫升

 陰性液（Reagent F）   500微升

產(chǎn)品說明書      1份

保存方式

保存 裂解液（Reagent B）和 底物液（Reagent D）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里； 底物液（Reagent D）避免光照，有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于反應(yīng)液配制以及樣品制備和保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

細(xì)胞刮脫棒：用于細(xì)胞脫離

微型臺式離心機：用于樣品制備

培養(yǎng)箱：用于孵育反應(yīng)物

比色皿或96孔板：用于比色的容器

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于比色分析

實驗步驟

• 樣品準(zhǔn)備 

• 準(zhǔn)備好25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶或60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測培養(yǎng)細(xì)胞（1至5 X 10⁶細(xì)胞）
• 小心加入3毫升 清理液（Reagent A），覆蓋生長表面
• 小心抽去清理液
• 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞（注意：可以使用胰酶消化）
• 加入3毫升 清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞
• 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細(xì)胞從這一步驟開始）
• 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入500微升 裂解液（Reagent B），充分混勻
• 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 強力渦旋震蕩15秒
• 置于冰槽里孵育30分鐘
• 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1；同時使用 裂解液（Reagent B）作為空白對照）
• 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

• 測定準(zhǔn)備

• 準(zhǔn)備好上述待測樣品，置于冰槽里
• 設(shè)定好分光光度儀（溫度為25℃）：波長470nm，并置零  
• 測讀開始前，移取100微升 底物液（Reagent D）到新的1.5毫升離心管，加入100微升 氧化液（Reagent E），輕柔混勻后，標(biāo)記為 反應(yīng)工作液，放在暗室里
•  緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

• 背景對照測定

• 移取800微升 緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入100微升含有 底物液（Reagent D）和 氧化液（Reagent E）的 反應(yīng)工作液
• 加入100微升 陰性液（Reagent F）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻
• 放進25℃培養(yǎng)箱里孵育5分鐘
• 即刻放入分光光度儀檢測，此為背景空對照 

• 樣品測定

• 移取800微升 緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入100微升含有 底物液（Reagent D）和 氧化液（Reagent E）的 反應(yīng)工作液
• 加入100微升上述準(zhǔn)備的樣品（100微克蛋白總量）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻 
• 放進25℃培養(yǎng)箱里孵育5分鐘
• 即刻放入分光光度儀檢測，此為樣品讀數(shù) 

• 計算樣品活性

[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X 1.0（體系容量；毫升）X 樣品稀釋倍數(shù)]÷[0.1（樣品容量；毫升）X 26.6（毫摩爾吸光系數(shù)）X 5（反應(yīng)時間；分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

單位＝微摩爾愈創(chuàng)木酚/分鐘

• 酶標(biāo)儀測定

• 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對照和樣品
• 分別移取200微升 緩沖液（Reagent C）到96孔板里
• 分別加入25微升含有 底物液（Reagent D）和 氧化液（Reagent E）的 反應(yīng)工作液
• 分別加入25微升 陰性液（Reagent F）或待測樣品（50微克蛋白總量）到相應(yīng)孔里
• 輕輕搖動96孔板
• 放進25℃培養(yǎng)箱里孵育5分鐘
• 即刻放進酶標(biāo)儀檢測：獲得背景和樣品讀數(shù)
• 活性計算：

[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X 0.25（體系容量；毫升）X 樣品稀釋倍數(shù)]÷[0.025（樣品容量；毫升）X 26.6（毫摩爾吸光系數(shù)）X 0.6（光徑距離；厘米）X 5（反應(yīng)時間；分鐘）]＝單位/毫升÷（稀釋后樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

單位＝微摩爾愈創(chuàng)木酚/分鐘

注意事項

• 本產(chǎn)品為20次（比色皿）和80次（96孔板）操作，包括背景對照
• 操作時，須戴手套
• 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次
• 樣品須澄清，至關(guān)重要 
• 比色測定后，比色皿須清洗*
• 樣本測定吸光值讀數(shù)越高，表明酶活性越高
• 反應(yīng)測定值隨著時間增加，吸光讀數(shù)逐漸增高；如果酶活過低，反應(yīng)孵育可以持續(xù)10至20分鐘，甚至60分鐘
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品容量
• 脊髓過氧化酶單位活性定義為：在25℃，pH 7.0條件下，每分鐘內(nèi)能夠氧化1微摩爾愈創(chuàng)木酚所需的酶量作為一個活性單位
• 本公司提供系列氧化酶類分析技術(shù)產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感