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 細胞逆轉錄酶（REVERSE TRANSCRIPTASE）活性熒光定量檢測試劑盒

產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

 細胞逆轉錄酶（REVERSE TRANSCRIPTASE）活性熒光定量檢測試劑是一種旨在通過雙鏈分子底物，在dTTP的參與下，通過逆轉錄酶的催化，聚合產(chǎn)生RNA-DNA異源雙鏈DNA分子，由PicoGreen特異染色，即采用熒光法來測定細胞裂解樣品中酶活性的*而經(jīng)典的技術方法。該技術經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種細胞裂解懸液樣品（動物、人體、昆蟲等）逆轉錄酶的活性，以及抑制劑檢測。產(chǎn)品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定。

技術背景

逆轉錄酶（REVERSE TRANSCRIPTASE；EC2.7.7.49），又稱為RNA依賴性DNA聚合酶（RNA-dependent DNA polymerase），是將單鏈RNA分子轉錄為雙鏈DNA的DNA聚合酶，包括HIV逆轉錄酶、莫洛尼氏鼠白血病病毒（Moloney murine leukemia virus；MMLV）逆轉錄酶、禽類成髓細胞瘤病毒（avian myeloblastosis virus；AMV）逆轉錄酶、端粒酶逆轉錄酶（telomerase reverse transcriptase） 等。逆轉錄病毒使用逆轉錄酶達到逆轉錄RNA為DNA，然后整合到宿主基因組再復制。在真核生物中，端粒酶是一種逆轉錄酶。逆轉錄酶在分子生物學中得到廣泛運用。檢測逆轉錄酶活性成為病毒感染的監(jiān)測手段，同時作為藥物篩選的靶標。基于由poly-A模板與oligo-dT引物構成的雙鏈分子底物，在dTTP的參與下，通過逆轉錄酶的催化，聚合產(chǎn)生RNA-DNA異源雙鏈DNA分子（heteroduplexes），由PicoGreen特異染色，根據(jù)熒光強度分析（激發(fā)波長480nm，散發(fā)波長520nm），來定量測定逆轉錄酶的活性。 

產(chǎn)品內(nèi)容

 清理液（Reagent A） 毫升

 裂解液（Reagent B） 毫升

 緩沖液（Reagent C） 毫升

 底物液（Reagent D） 微升

 終止液（Reagent E） 微升

 染色液（Reagent F） 微升

 稀釋液（Reagent G） 毫升

 標準液（Reagent H） 微升

產(chǎn)品說明書    1份

保存方式

保存 清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里； 染色液（Reagent F）避免光照；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

細胞刮脫棒：用于細胞脫離

DOUNCE勻漿器：用于裂解組織

臺式離心機：用于樣品操作

比色皿或酶標板：用于熒光分析的容器

熒光分光光度儀或熒光酶標儀：用于熒光分析

實驗步驟

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的 裂解液（Reagent B）置入冰槽里融化。然后進行下列操作。

• 樣品準備

• 準備好25cm²細胞培養(yǎng)瓶或60mm細胞培養(yǎng)皿的待測培養(yǎng)細胞（1至5 X 10⁶細胞）
• 小心加入xx毫升 清理液（Reagent A），覆蓋生長表面
• 小心抽去清理液
• 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞（注意：可以使用胰酶消化）
• 加入xx毫升 清理液（Reagent A），混勻細胞
• 移入到預冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始）
• 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入置于冰槽里的xx微升 裂解液（Reagent B） 
• 強力渦旋震蕩30秒，充分混勻
• 即刻放入預冷的DOUNCE勻漿器
• 在冰槽里用勻漿棒勻化組織（約80下）
• 將所有組織勻漿物移入15毫升錐形離心管
• 即刻放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為10000g
• 小心移取上清液到新的無菌的1.5毫升離心管
• 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用  Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－ MB30030.1）
• 放進－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里備用

• 測定準備

• 準備好待測樣品（例如細胞裂解萃取液或純化酶樣品等），置于冰槽里
• 設定好熒光酶標儀（溫度為25℃）：激發(fā)波長490nm，散發(fā)波長520nm
• 準備好5個1.5毫升離心管，標記為1至5號管
• 分別加入xx微升 裂解液（Reagent B）到1至5號管
• 移取xx微升 標準液（Reagent H）到1號管，混勻
• 小心移取xx微升1號管稀釋的 標準液（Reagent H）到2號管，混勻
• 小心移取xx微升2號管稀釋的 標準液（Reagent H）到3號管，混勻
• 小心移取xx微升3號管稀釋的 標準液（Reagent H）到4號管，混勻
• 將1至5號管放進冰槽里備用；標準管濃度見下表

三、標準曲線構建

測定開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的 染色液（Reagent F）置入冰槽里融化，然后移出2.5微升到新的1.5毫升離心管，加入xx微升 稀釋液（Reagent G），輕柔混勻后，置于冰槽里，標記為 反應工作液（注意：5次操作量），放在暗室里備用。然后進行下列操作

• 在96孔板上做好相應標記：標準樣品
• 移取xx微升 緩沖液（Reagent C）到96孔板的對應孔里
• 分別加入xx微升 底物液（Reagent D）
• 分別加入5微升上述配制的標準液
• 分別加入xx微升 終止液（Reagent E）
• 分別加入xx微升 染色工作液
• 室溫下孵育5分鐘，避免光照
• 即刻放進熒光酶標儀檢測：獲得相對熒光讀數(shù)RFU（Relative Fluorescence Unit）
• 實際熒光讀數(shù)：標準樣品相對熒光讀數(shù)－5號管標準樣品相對熒光讀數(shù)（作為背景空對照）
• 構建標準曲線：縱座標（Y軸）為實際熒光單位RFU；橫座標（X軸）為標準DNA濃度（納克/毫升）

四、樣品測定

測定開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的 染色液（Reagent F）置入冰槽里融化，然后移出2.5微升到新的1.5毫升離心管，加入xx微升 稀釋液（Reagent G），輕柔混勻后，置于冰槽里，標記為 反應工作液（注意：5次操作量），放在暗室里備用。然后進行下列操作

• 在96孔板上做好相應標記：待測樣品
• 移取xx微升 緩沖液（Reagent C）到96孔板的對應孔里
• 加入xx微升 底物液（Reagent D）
• 加入5微升待測樣品（注意：10微克純化酶蛋白或50微克裂解懸液蛋白）
• 室溫下孵育60分鐘
• 分別加入xx微升 終止液（Reagent E）
• 分別加入xx微升 染色工作液
• 室溫下孵育5分鐘，避免光照
• 即刻放進熒光酶標儀檢測：獲得相對熒光讀數(shù)RFU（Relative Fluorescence Unit）
• 實際熒光讀數(shù)：待測樣品相對熒光讀數(shù)－5號管標準樣品相對熒光讀數(shù)（作為背景空對照）
• 根據(jù)標準曲線獲得樣品對應DNA濃度（納克/毫升）
• 實際活性計算：

注意事項

• 本產(chǎn)品為20次操作
• 操作時，須戴手套
• 系統(tǒng)操作過程中，標準曲線測定只需1次
• 樣品須澄清，至關重要
• 樣品中避免使用EDTA、EGTA、NaCl、MgCl2、Triton X-100等
• 反應完成后即刻進行熒光測定
• 測定值由低到高變化
• 樣本測定樣品讀數(shù)高于背景讀數(shù)表明具有酶活性
• 待測樣本為粗提酶樣品，其蛋白濃度為10微克/5微升；待測樣本為細胞裂解懸液，其蛋白濃度為50微克/5微升（本公司提供   Bradford蛋白質濃度定量試劑盒 MB30030.1）
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度
• 逆轉錄酶單位活性定義為：在25℃，pH 8.1條件下，每小時內(nèi)能夠轉錄1納克DNA所需的酶量作為一個活性單位
• 本公司提供系列逆轉錄酶檢測試劑產(chǎn)品

質量標準

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感