MB50309.2 v.A

 組織血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化酶2（ACE2）活性熒光定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書

（中文版）

主要用途

 組織血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化酶2（ACE2）活性熒光定量檢測試劑是一種旨在通過三肽化合物底物馬尿酰組氨酰亮氨酸，在血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化酶1抑制劑的存在下，受到血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化酶2的水解，釋放出組氨酰亮氨酸，與非熒光性染料鄰苯二甲醛反應(yīng)產(chǎn)生高度熒光的二肽加合物后熒光峰值的變化，來測定組織裂解萃取樣品中酶活性的*而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種組織裂解萃取液樣品（動物、人體、昆蟲等）血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化酶2（ACE2）的特異活性檢測，以及抑制劑和激活劑的篩選。產(chǎn)品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，具有高通量、自動化操作的優(yōu)點。

技術(shù)背景

血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化酶（angiotensin I-converting enzyme；ACE；EC3.4.15.1），又稱為肽基二肽酶A（peptidyl dipeptidase A）、羧基組織蛋白酶（carboxycathepsin）或激肽酶II（kininase II），是一種體細胞類150至180KD、生殖細胞類90至110KD的多肽外切酶（exopeptidase）和鋅金屬肽酶（zinc metallopeptidase）。血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化酶有2種同工酶：1型和2型，其間80至90%同源。I型主要存在于肺毛細管細胞內(nèi)，也在血管內(nèi)皮細胞、腎上皮細胞和睪丸leydig細胞膜中表達；II型主要存在于心臟和腎臟血管內(nèi)皮細胞膜上。ACE在腎素-血管緊張素-醛固酮（aldosterone）系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。作為血管收縮劑（vasoconstrictor），ACE催化十肽血管緊張素I的C末端的組胺酰亮氨酸（histidylleucine）二肽的切離水解反應(yīng)，轉(zhuǎn)化為血管緊張素II；同時作為血管擴張劑（vasodilator），ACE使緩激肽（bradykinin）失活。ACE常用于藥物靶標，治療高血壓（例如噻嗪化物thiazide）、心力衰竭（例如利尿靈furosemide）、糖尿病腎病和SARS等疾患。基于人工合成的三肽化合物底物N-馬尿酰-L-組氨酰-L-亮氨酸（hippuryl-L-histidyl-L-leucine；HHL），在血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化酶1抑制劑甲羥孕酮醋酸酯（Foroxymithine）的存在下，受到血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化酶2的水解，釋放出組氨酰亮氨酸（L-histidyl-L-leucine；HL），與非熒光性染料鄰苯二甲醛（o- phthaldialdehyde；OPA）反應(yīng)，生成高度熒光的二肽加合物后熒光峰值的變化（激發(fā)波長360nm，散發(fā)波長485nm），來定量測定血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化酶2的特異活性。血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化酶2反應(yīng)系統(tǒng)為：

產(chǎn)品內(nèi)容

 清理液（Reagent A）  毫升

 裂解液（Reagent B）  毫升

 緩沖液（Reagent C）  毫升

 底物液（Reagent D）    微升

 終止液（Reagent E）    毫升

 反應(yīng)液（Reagent F）  微升

 中和液（Reagent G）    微升

 標準液（Reagent H）    微升

產(chǎn)品說明書   1份

保存方式

保存 底物液（Reagent D）、 反應(yīng)液（Reagent F）和 標準液（Reagent H）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里； 底物液（Reagent D）和 反應(yīng)液（Reagent F）避免光照； 終止液（Reagent E）和 中和液（Reagent G）具有腐蝕性，注意操作安全；有效保證6月

用戶自備

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

1.5毫升離心管：用于樣品制備和儲存的容器

超速離心管：用于樣品離心的容器

臺式離心機：用于樣品沉淀

4℃超速離心機：用于分離膜蛋白成分

DOUNCE勻漿器：用于裂解組織細胞

超聲儀：用于裂解樣品

培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)物孵育

比色皿或96孔板：用于比色的容器

熒光分光光度儀或熒光酶標儀：用于熒光分析

實驗步驟

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑置入冰槽里融化。 反應(yīng)液（Reagent F）避免光照。然后進行下列操作。

• 樣品準備 

• 手術(shù)取出動物組織，并秤重以確定200至500毫克組織重量 
• （選擇步驟）放進預(yù)冷的15毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入xx毫升 清理液（Reagent A）清洗1次
• 移入到一個液氮凍存管
• 即刻放進液氮罐過夜
• 次日從液氮罐里取出，即刻（*速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）
• 放進一個15毫升錐形離心管
• 加入預(yù)冷的xx至xx微升 裂解液（Reagent B） 
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 即刻放入預(yù)冷的DOUNCE勻漿器
• 在冰槽里用研磨棒勻化組織（約80下） 
• 將所有組織勻漿物移入15毫升錐形離心管
• 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1500g
• 小心移出上清液到另一個新的預(yù)冷的超速離心管，轉(zhuǎn)至步驟17
• 加入xx微升 裂解液（Reagent B），混勻沉淀顆粒
• 超聲處理：200瓦，50%功率，5秒一次，間隔3分鐘，重復(fù)2次——此步驟獲得粗提總蛋白
• （選擇步驟）放進上述超速離心管到4℃超速離心機離心30分鐘，速度為40000g
• （選擇步驟）小心移出上清液到到預(yù)冷的1.5毫升離心管——此步驟獲得膜蛋白
• 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）
• 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

• 測定準備

• 準備好上述待測樣品，置于冰槽里
• 設(shè)定好熒光分光光度儀或熒光酶標儀（溫度為37℃）：激發(fā)波長360nm，散發(fā)波長485nm，并設(shè)置增益倍數(shù)150至200
• 準備好5個1.5毫升離心管，標記為1至5號管
• 分別加入xx微升 清理液（Reagent A）到1至5號管
• 移取xx微升 標準液（Reagent H）到1號管，混勻
• 小心移取xx微升1號管稀釋的 標準液（Reagent H）到2號管，混勻
• 小心移取xx微升2號管稀釋的 標準液（Reagent H）到3號管，混勻
• 小心移取xx微升3號管稀釋的 標準液（Reagent H）到4號管，混勻
• 將1至5號管放進冰槽里備用，避免光照；標準管濃度見下表

• 標準曲線測定

• 移取xx微升 緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升上述配制的 標準液（Reagent H）
• 加入xx微升 終止液（Reagent E），混勻
• 加入xx微升 反應(yīng)液（Reagent F），混勻
• 室溫下孵育10分鐘，避免光照
• 加入xx微升 中和液（Reagent G），混勻
• 即刻放進熒光分光光度儀檢測：獲得相對熒光讀數(shù)
• 重復(fù)實驗步驟1至7四次
• 構(gòu)建標準曲線：縱座標（Y軸）為相對熒光單位；橫座標（X軸）為標準組氨酰亮氨酸濃度（微摩爾/升）

• 樣品測定

• 移取xx微升 緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升 底物液（Reagent D）
• 加入10微升待測樣品（注意：50微克總蛋白或20微克膜蛋白） 
• 在37℃溫度下孵育30分鐘
• 加入xx微升 終止液（Reagent E），混勻
• 加入xx微升 反應(yīng)液（Reagent F），混勻
• 室溫下孵育10分鐘，避免光照
• 加入xx微升 中和液（Reagent G），混勻
• 即刻放進熒光分光光度儀檢測：獲得相對熒光讀數(shù)
• 根據(jù)標準曲線獲得樣品對應(yīng)組氨酰亮氨酸濃度（微摩爾/升）

• 計算樣品活性

• 酶標儀測定

• 在96孔板上做好相應(yīng)標記：標準樣品和待測樣品
• 分別移取xx微升 緩沖液（Reagent C）到相應(yīng)孔里
• 加入xx微升 底物液（Reagent D）到待測樣品孔里
• 加入xx微升 緩沖液（Reagent C）到標準樣品孔里
• 分別加入10微升待測樣品（50微克總蛋白或20微克膜蛋白）或上述制備的 標準液（Reagent H）到相應(yīng)孔中里
• 在37℃溫度下孵育30分鐘
• 分別加入xx微升 終止液（Reagent E）
• 輕輕搖動96孔板
• 分別加入xx微升 反應(yīng)液（Reagent F）
• 輕輕搖動96孔板
• 室溫下孵育10分鐘，避免光照
• 加入xx微升 中和液（Reagent G），混勻
• 輕輕搖動96孔板
• 即刻放進熒光酶標儀檢測：獲得相對熒光讀數(shù)
• 構(gòu)建標準曲線：縱座標（Y軸）為相對熒光單位；橫座標（X軸）為標準組氨酰亮氨酸濃度（微摩爾/升）
• 根據(jù)標準曲線獲得樣品對應(yīng)組氨酰亮氨酸濃度（微摩爾/升）
• 活性計算：

注意事項

• 本產(chǎn)品為20次操作，包括背景對照
• 操作時，須戴手套
• 樣品避免使用EDTA和EGTA等處理
• 建議樣品保存在－70℃冰箱里 
• 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次
• 測定值由低到高變化；測定可以持續(xù)30分鐘 
• 熒光測定后，比色皿須清洗*
• 樣本測定30分鐘讀數(shù)高于0分鐘讀數(shù)表明具有酶活性
• 建議待測樣本為總蛋白，其濃度為50微克/10微升；待測樣本為膜蛋白，其濃度為20微克/10微升；如果樣本酶活性過低或過高， 則可以增加或降低樣本量（本公司提供   Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒GMS30030.1）
• 如果用戶沒有匹配的熒光濾波器，可以使用340至365nm激發(fā)波長和455至495nm散發(fā)波長的任一波長替代
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度
• 標準曲線參考圖像如下：計算公式為Y=19.748X + 10.585

• 樣品中含有某種氨基肽酶，可能干擾檢測，可以使用100微摩爾對氯汞苯甲酸（p-chloromercnribenzoate；PCMB）去除
• 可以使用血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化酶2抑制劑DX600（IC50=10微摩爾）作為抑制劑對照或陰性對照
• 血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化酶2單位活性定義為：在37℃，pH 8.3條件下，每小時內(nèi)能夠水解釋放1微摩爾組氨酰亮氨酸所需的酶量作為一個活性單位
• 本公司提供系列血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化酶類檢測試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標準

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感