組織總抗氧化能力（TAC）比色法（DPPH）定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書

（中文版）

主要用途

 組織總抗氧化能力（TAC）比色法（DPPH）定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)有機(jī)氮自由基染料DPPH的參與，在抗氧化劑的存在下，通過(guò)分光光度儀，觀察其峰值下降的變化，來(lái)定量檢測(cè)對(duì)應(yīng)于標(biāo)準(zhǔn)水溶性生育酚Trolox的總抗氧化能力，即消除自由基等值濃度的*而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。適用于各種新鮮組織（動(dòng)物、人體、植物、昆蟲等）的總抗氧化能力檢測(cè)。可以被用于細(xì)胞凋亡、衰老、代謝和營(yíng)養(yǎng)學(xué)等的研究。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)易，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

超氧自由基陰離子（superoxide radical；O2^-）、過(guò)氧化氫（hydrogen peroxide；H2O2）、羥自由基或氫氧基（hydroxyl radical；OH^-）、過(guò)氧化基（peroxyl radical；ROO^-）、氫過(guò)氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO^-）、過(guò)氧亞硝基陰離子（peroxynitrite anion；ONOO^-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、單線態(tài)氧氣（singlet oxygen）等細(xì)胞內(nèi)活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的產(chǎn)生和增多，將導(dǎo)致細(xì)胞衰老或凋亡，甚而導(dǎo)致諸如冠心病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腫瘤、退行性病變等各種病理狀況。在生物系統(tǒng)內(nèi)，通過(guò)抗氧化酶例如超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶等，大分子，例如白蛋白、銅藍(lán)蛋白（ceruloplasmin；CER）、鐵蛋白（ferritin）和抗氧化因子，例如生育醇、類胡蘿卜素、抗壞血酸、還原性谷胱甘肽和尿酸膽紅素（bilirubin）等，產(chǎn)生抗氧化能力，即捕獲自由基的能力，達(dá)到消除或降低ROS的損害。通過(guò)穩(wěn)定的有機(jī)氮自由基染料1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazylradical；DPPH），受到抗氧化劑的去自由基作用，呈現(xiàn)深紫色轉(zhuǎn)化為黃色的變化，衡量體系中抗氧化劑捕獲自由基、消耗抗氧化劑的能力，在分光光度儀（515nm波長(zhǎng)）的幫助下，觀察其峰值下降的變化，并與標(biāo)準(zhǔn)化抗氧化劑水溶性生育酚Trolox對(duì)照。

產(chǎn)品內(nèi)容

 清理液（Reagent A）     毫升

 低滲液（Reagent B）     毫升

 緩沖液（Reagent C）     毫升

 染色液A（Reagent D1）     瓶

 染色液B（Reagent D2）     毫升

 標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）     微升

產(chǎn)品說(shuō)明書     1份

保存方式

保存 清理液（Reagent A）在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里，有效保證6月

用戶自備

15毫升錐形離心管：用于組織樣品操作的容器

2毫升離心管：用于組織樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于組織裂解懸液存放的容器

4℃微型臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品操作

超聲儀：用于破碎組織細(xì)胞

200微升1厘米光徑比色皿或96孔板：用于比色的容器

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于比色分析

實(shí)驗(yàn)步驟

• 樣品準(zhǔn)備

• 手術(shù)取出動(dòng)物組織，并秤重以確定組織重量200毫克
• 移入到一個(gè)液氮凍存管
• 即刻放進(jìn)液氮罐過(guò)夜
• 次日從液氮罐里取出，即刻（*速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）
• 放進(jìn)一個(gè)15毫升錐形離心管
• 加入xx毫升4℃預(yù)冷的  清理液（Reagent A）
• 強(qiáng)力渦旋震蕩30秒，充分混勻
• 轉(zhuǎn)移到4℃預(yù)冷的2毫升離心管
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為400g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入xx毫升4℃預(yù)冷的  清理液（Reagent A），混勻
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為400g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽去上清液
• 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟11至13二次
• 加入xx微升 低滲液（Reagent B），混勻
• 置于200瓦超聲儀槍頭下，離心管在冰槽里
• 超聲功率為100％，猝擊10秒，2個(gè)循環(huán)
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g（或10000RPM，例如eppendorf 5415）
• 移取上清液到新的4℃預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（建議使用  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）
• 使用 清理液（Reagent A）調(diào)整蛋白濃度為100微克/10微升
• 置于冰槽里待測(cè)

二、標(biāo)準(zhǔn)液準(zhǔn)備

• 準(zhǔn)備好5個(gè)1.5毫升離心管，標(biāo)記為1至5號(hào)管
• 分別加入xx微升 緩沖液（Reagent C）到2至5號(hào)管
• 移取xx微升 標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到1號(hào)管，混勻
• 小心移取xx微升1號(hào)管的 標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到2號(hào)管，混勻
• 小心移取xx微升2號(hào)管稀釋的 標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到3號(hào)管，混勻
• 小心移取xx微升3號(hào)管稀釋的 標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到4號(hào)管，混勻
• 將1至5號(hào)管放進(jìn)冰槽里備用，避免光照；標(biāo)準(zhǔn)管濃度見(jiàn)下表

• 樣品測(cè)讀

實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑置于室溫下融化，移取xx毫升 染色液B（Reagent D2）到1瓶 染色液A（Reagent D1）里，混勻，置于暗室里，標(biāo)記為 染色工作液，避免光照。然后進(jìn)行下列操作。

• 準(zhǔn)備1個(gè)96孔板，做好標(biāo)記：空白對(duì)照孔、標(biāo)準(zhǔn)樣品孔、待測(cè)樣品孔
• 分別移取xx微升 緩沖液（Reagent C）到96孔板里的每個(gè)孔里
• 分別加入xx微升 染色工作液 
• 加入xx微升 緩沖液（Reagent C）到空白對(duì)照孔
• 加入xx微升上述配制的 標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)樣品孔里
• 加入20微升樣品（100微克蛋白總量）到待測(cè)樣品孔里
• 輕輕搖動(dòng)96孔板，使其混勻
• 室溫下孵育15分鐘
• 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀里測(cè)讀：515nm波長(zhǎng)
• 分析結(jié)果：
  • 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：縱座標(biāo)（Y軸）為吸光單位（OD515nm）；橫座標(biāo)（X軸）為標(biāo)準(zhǔn)Trolox濃度（微摩爾/升）
  • 空白對(duì)照孔為大吸光單位（OD515nm）讀數(shù)
  • 標(biāo)準(zhǔn)樣品孔和待測(cè)樣品孔為實(shí)際吸光單位（OD515nm）讀數(shù)
  • 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對(duì)應(yīng)Trolox濃度（微摩爾/升）
  • 計(jì)算樣品實(shí)際總抗氧化能力

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為50次操作，包括標(biāo)準(zhǔn)品
• 本產(chǎn)品測(cè)試范圍為10至100微摩爾Trolox等值
• 操作時(shí)，須戴手套
• 樣品制備的所有操作均須在4℃狀態(tài)下進(jìn)行
• 用戶可以調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)曲線區(qū)間
• 測(cè)試前，樣品須新鮮收集
• 樣品須清澈
• 空白對(duì)照孔的吸光讀數(shù)應(yīng)為1.0左右為佳
• 樣品讀數(shù)越低，抗氧化能力越高
• 可以使用比色皿檢測(cè)
• 如果樣品抗氧化劑濃度過(guò)高或過(guò)低， 建議稀釋或增加樣品容量或濃度
• 建議待測(cè)樣本的蛋白濃度為100微克/20微升（本公司提供   Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒GMS30030.1）
• 如果測(cè)試樣品很多，建議使用排槍移液
• 本公司提供系列抗氧化分析試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感