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用細(xì)胞刮刀實(shí)驗(yàn)時(shí)
用細(xì)胞刮刀實(shí)驗(yàn)時(shí)
實(shí)驗(yàn)步驟：無(wú)菌條件下取新生小牛大腦皮層灰質(zhì)部，4℃D-Hank′s液洗滌4次，至無(wú)血跡殘留。剪成1mm3左右的組織碎塊并置于玻璃勻漿器內(nèi)，加入兩倍體積的MEM培養(yǎng)基，勻漿上下20次？勻漿液先用100目（直徑149μm）尼龍網(wǎng)布式漏斗抽濾，培養(yǎng)基洗滌4次，收集濾液。然后用200目（直徑74μm）尼龍網(wǎng)布式漏斗抽濾，MEM培養(yǎng)基洗滌4次。細(xì)胞刮刀收集200目尼龍網(wǎng)上的組織（即牛腦微血管），將其置于離心管中，1500r/min離心洗滌10min。離心洗滌的腦微血管懸浮于的0.1%膠原酶中，旋渦振蕩15sec以充分混勻，置于37℃恒溫振蕩水浴箱中振蕩消化50min？取出后旋渦振蕩15sec，1500r/min離心10min，棄上清，用20%BCS的培養(yǎng)基懸浮，接種于明膠鋪被的培養(yǎng)瓶中（培養(yǎng)瓶中加入1%明膠-D-Hank′s液洗滌3ml，37℃孵箱中放置24h，用前倒掉明膠溶液即得明膠覆蓋的培養(yǎng)瓶），置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。靜置5～7天后，可見(jiàn)少量細(xì)胞生長(zhǎng)，20%BCS的MEM培養(yǎng)液換液，以后每2～3天換液一次，至細(xì)胞長(zhǎng)成致密單層后可傳代培養(yǎng)。
1、提前準(zhǔn)備好Matrigel（BD 354277）包被過(guò)的六孔板，吸棄孔內(nèi)包被液，加入2ml BeYaMATM 1*培養(yǎng)液。
2、吸棄待傳代hESCs/hiPSCs孔內(nèi)的培養(yǎng)液，并用1ml無(wú)鈣鎂的PBS洗1遍。
3、加入0.5ml Accutase細(xì)胞分離液使之*覆蓋皿底。
4、室溫孵育5-8分鐘或37℃孵育3-5分鐘，顯微鏡下觀察到大部分克隆細(xì)胞間出現(xiàn)間隙，細(xì)胞表面發(fā)亮但尚未相互分離時(shí)，可吸去Accutase。
5、可將培養(yǎng)板放置37℃繼續(xù)孵育1min,或者直接加入適量新鮮BeYaMATM 1*培養(yǎng)液，輕輕搖晃，干細(xì)胞集落基本脫落。亦可用細(xì)胞刮刀將剩余克隆輕輕刮下，盡量避免用槍頭反復(fù)吹打細(xì)胞。
6、將制備好的細(xì)胞懸液按1：3-1：6的比例接種至準(zhǔn)備好的培養(yǎng)板中，注意細(xì)胞過(guò)密則克隆邊界不圓滑，易分化，細(xì)胞過(guò)稀則克隆存活率降低。
7、輕輕搖晃培養(yǎng)板讓細(xì)胞均勻分散，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8小時(shí)。
8、每天更換培養(yǎng)液，待細(xì)胞密度達(dá)到80%以上，或者克隆中央密度過(guò)大，影響細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)進(jìn)行傳代。
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