溫育和洗板：ELISA試劑盒溫育時(shí)間和溫度一般根據(jù)試劑盒的說明書進(jìn)行選擇。溫育時(shí)可以采用水浴或者濕盒孵育,避免“邊緣效應(yīng)”。①手工洗板時(shí)，拍板時(shí)要垂直，避免交叉污染，用力不能過猛，防止抗原抗體復(fù)合物脫離；②洗板機(jī)洗板時(shí)應(yīng)經(jīng)常檢查沖洗頭是否通暢。
顯色：市售ELISA 試劑盒中，一般是以四甲基聯(lián)苯胺(TMB)為底物的顯色液，反應(yīng)條件為37℃或室溫反應(yīng)15～30 min。顯色反應(yīng)需要避光。
讀數(shù)和數(shù)據(jù)分析：終止后讀取結(jié)果盡量在15min內(nèi)完成，讀取OD值時(shí)酶標(biāo)儀需先預(yù)熱15～30 min再進(jìn)行。數(shù)據(jù)分析一般用四參數(shù)和直線擬合法，選擇哪種擬合方式，可以依據(jù)標(biāo)曲的相關(guān)系數(shù)（R2）來確定，R2一般需要大于0.99。
樣本的準(zhǔn)備：ELISA試劑盒盡量使用新鮮樣本，不使用有溶血，被細(xì)菌污染、標(biāo)本保存時(shí)間過長和標(biāo)本凝固不全的樣本。ELISA檢測宜采集新鮮標(biāo)本，如不能立即測定，5天之內(nèi)應(yīng)4℃保存，對于1周后檢測的樣本應(yīng)低溫凍存；做好分裝，長時(shí)間凍存的樣本避免反復(fù)凍融。
仔細(xì)閱讀說明書，熟悉整個(gè)流程，推薦畫出簡要步驟圖；提前準(zhǔn)備試劑，比如常見20X洗滌液是濃縮液，需要用超純水提前稀釋準(zhǔn)備好。一般的檢測抗體和酶標(biāo)二抗需要用對應(yīng)的稀釋液稀釋至工作濃度。
不同批次的試劑不要混用，檢查各組分的有效期。
ELISA試劑盒預(yù)包被的酶標(biāo)板條和各試劑組份需要室溫平衡30 min以上，這樣做的目的能使反應(yīng)微孔內(nèi)的溫度較快地達(dá)到所需溫度，預(yù)防后續(xù)實(shí)驗(yàn)中由于孵育溫度或是時(shí)間不夠充分，而將一些弱陽性樣本不能檢出。
待測樣本加樣：待檢樣本過多時(shí)，建議分批操作；需要稀釋的樣本提前做好稀釋，注意選對合適稀釋液；控制好加樣時(shí)間，避免加樣費(fèi)時(shí)過長造成誤差；注意加樣角度，垂直加入孔底，不要接觸孔壁, 做到一份樣本一個(gè)移液頭，防止交叉污染。