活體細(xì)胞線粒體膜通道孔（MPTP）熒光檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書（中文版）

主要用途

 活體細(xì)胞線粒體膜通道孔（MPTP）熒光檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)鈣黃綠素－鈷技術(shù)，選擇性地聚集在線粒體內(nèi)呈現(xiàn)熒光染色，而存在于或由線粒體釋放到細(xì)胞漿的熒光染料，即刻發(fā)生熒光淬滅，來(lái)分析和觀察線粒體膜通道孔活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種活體細(xì)胞線粒體（動(dòng)物、人體、昆蟲等）膜通道孔活性（瞬時(shí)或長(zhǎng)期開放狀態(tài)）的檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，活體檢測(cè)，分辨率高，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

線粒體膜通道孔（mitochondrial permeability transition pore；MPTP）是由線粒體內(nèi)外膜成分構(gòu)成的非特異性且鈣離子依賴性通道。在細(xì)胞凋亡或壞死時(shí)，線粒體內(nèi)容物通過(guò)膜通道孔釋放到胞漿中。膜通道孔的開放，顯著改變線粒體的通透性。鈣離子過(guò)度進(jìn)入、線粒體谷胱苷肽的氧化和活性氧族水平的增加等導(dǎo)致膜通道孔的持續(xù)開放，而造成細(xì)胞色素C的釋放和線粒體膜電位的消失。鈣黃綠素-AM，又稱雙甲亞胺二乙酸鈉熒光素－乙酰氧基甲基酯【bis（bis-carboxymethyl amino methyl fluorescein）-acetoxymethyl ester】，作為熒光探針：*，適宜的分子量622kd，小于1.5kd；第二，幾乎不具有膜結(jié)合性；第三，不是線粒體酶的底物；第四，容易進(jìn)入細(xì)胞及其線粒體。鈣黃綠素-AM進(jìn)入細(xì)胞后，被細(xì)胞內(nèi)酯酶切離，產(chǎn)生具有極性的熒光性強(qiáng)的鈣黃綠素。鈣黃綠素進(jìn)入線粒體后，被線粒體俘獲。同時(shí)胞漿內(nèi)的鈣黃綠素受到其淬滅劑鈷離子的淬滅。一旦線粒體膜通道孔瞬時(shí)開放，鈣黃綠素釋放出來(lái)，被鈷離子淬滅。線粒體內(nèi)鈣黃綠素?zé)晒獾淖兓砻髂ねǖ揽椎拈_放狀態(tài)。

產(chǎn)品內(nèi)容

 清理液（Reagent A） 100毫升

 染色液（Reagent B） 100微升

 中和液（Reagent C）  10毫升

產(chǎn)品說(shuō)明書   1份

保存方式

保存 染色液（Reagent B）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；有效保證6月

用戶自備

24孔細(xì)胞培養(yǎng)板：用于貼壁細(xì)胞染色的容器

1.5毫升離心管：用于染色工作液配制和細(xì)胞染色的容器

微型臺(tái)式離心機(jī)：用于沉淀細(xì)胞

培養(yǎng)箱：用于染色孵育

（共聚焦）熒光顯微鏡：用于細(xì)胞熒光分析

熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀：用于細(xì)胞熒光定量分析

細(xì)胞流式儀：用于細(xì)胞熒光分析

實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的 染色液（Reagent B）置入冰槽里融化， 中和液（Reagent C）放進(jìn)37℃恒溫水槽里預(yù)熱。然后移出5微升 染色液（Reagent B）到新的1.5毫升離心管，加入500微升 中和液（Reagent C），混勻后，標(biāo)記為 染色工作液，置入暗室里。然后進(jìn)行下列操作。

• 貼壁細(xì)胞染色

• 準(zhǔn)備1個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)24孔板的待測(cè)細(xì)胞（注意：可以使用載玻片，載玻片培養(yǎng)皿，35mm培養(yǎng)皿，和其它培養(yǎng)孔板，見(jiàn)注意事項(xiàng)8）
• 小心抽去細(xì)胞培養(yǎng)液
• 小心沿著孔壁加入500微升37℃預(yù)熱的 清理液（Reagent A）到1個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)孔，覆蓋培養(yǎng)孔表面
• 小心抽去清理液
• 小心沿著孔壁加入500微升含有 染色液（Reagent B）和 中和液（Reagent C）的 染色工作液到1個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)孔，覆蓋培養(yǎng)孔表面
• 放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育20分鐘，避免光照
• 小心抽去 染色工作液
• 小心沿著孔壁加入500微升37℃預(yù)熱的 清理液（Reagent A）到細(xì)胞培養(yǎng)孔
• 小心抽去清理液
• 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟8和9一次
• 小心沿著孔壁加入500微升37℃預(yù)熱的 清理液（Reagent A）到細(xì)胞培養(yǎng)孔
• 選擇下列方式之一進(jìn)行操作：

（A）使用倒置熒光顯微鏡觀察（定性檢測(cè)）：

激發(fā)波長(zhǎng)488nm，散發(fā)波長(zhǎng)505nm――綠色熒光減弱，表明膜通道孔活性（MPTP）增強(qiáng)

• 使用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)（定量檢測(cè)）：

放進(jìn)熒光分光光度儀：激發(fā)波長(zhǎng)488nm，散發(fā)波長(zhǎng)505nm――RFU降低，表明膜通道孔活性（MPTP）增強(qiáng)

• 懸浮細(xì)胞或脫離細(xì)胞染色

• 將懸浮細(xì)胞或脫離細(xì)胞（1 X 10⁶細(xì)胞）移入到1.5毫升離心管
• 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入500微升37℃預(yù)熱的 清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞顆粒群
• 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入500微升含有 染色液（Reagent B）和 中和液（Reagent C）的 染色工作液，充分混勻 
• 放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育20分鐘，避免光照
• 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入500微升37℃預(yù)熱的 清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞顆粒群
• 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽去上清液
• 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟11至13一次
• 加入500微升37℃預(yù)熱的 清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞顆粒群
• 選擇下列方式之一進(jìn)行操作：
  • 進(jìn)行細(xì)胞流式儀分析（每隔5分鐘檢測(cè)一次，持續(xù)30分鐘）：波長(zhǎng)488nm氬離子激光，觀察50000個(gè)細(xì)胞以上――

波峰左移，表明膜通道孔活性（MPTP）增強(qiáng)

• 或使用（共聚焦）熒光顯微鏡觀察（定性檢測(cè)）：

1）移取10微升上述細(xì)胞懸液到載波片上，蓋上蓋玻片（每隔5分鐘檢測(cè)一次，持續(xù)30分鐘）

2）激發(fā)波長(zhǎng)488nm，散發(fā)波長(zhǎng)505nm――

綠色熒光減弱，表明膜通道孔活性（MPTP）增強(qiáng)

• 或使用熒光分光光度儀檢測(cè)（定量檢測(cè)）：

1）移取500微升上述細(xì)胞懸液到1毫升比色杯

2）加入500微升 清理液（Reagent A）

3）上下傾倒混勻數(shù)次

4）放進(jìn)熒光分光光度儀（每隔5分鐘檢測(cè)一次，持續(xù)30分鐘）：激發(fā)波長(zhǎng)488nm，散發(fā)波長(zhǎng)505nm――

RFU降低，表明膜通道孔活性（MPTP）增強(qiáng)

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為20次（0.5毫升體系/次）操作
• 操作時(shí)，須戴手套
• 操作時(shí)，避免污染母液
• 染色前，所有試劑溶液，除 染色液（Reagent B）外，需37℃預(yù)熱
• 建議細(xì)胞染色完成后，即刻進(jìn)行熒光檢測(cè)分析
• 孵育時(shí)，必須避免光照
• 本產(chǎn)品友好使用于雙重染色或重疊染色
• 本產(chǎn)品適合各種規(guī)格的培養(yǎng)細(xì)胞：載玻片，載玻片培養(yǎng)皿，35mm培養(yǎng)皿，和各種培養(yǎng)孔板，須相應(yīng)調(diào)整處理液：

• 如果不具備505nm散發(fā)波長(zhǎng)的濾波器，可以使用505nm至530nm中的任一波長(zhǎng)
• 如果黑色96孔板的背景讀數(shù)過(guò)高，可以選擇530nm散發(fā)波長(zhǎng)
• 如果膜通道孔為瞬時(shí)開放（transient），則熒光緩慢且自發(fā)降低
• 本公司提供膜通道孔抑制劑：  0.2毫摩爾環(huán)胞素A（cyclosporine A）－GMS12226，維護(hù)熒光完整
• 本公司提供系列線粒體分析試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定熒光清晰