細胞內質網(wǎng)內鈣離子濃度熒光檢測試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

 細胞內質網(wǎng)內鈣離子濃度熒光檢測試劑是一種旨在通過內質網(wǎng)鈣離子特異性熒光探針Mag-Fluo-AM，與鈣離子結合后，其熒光強度顯著增強，在熒光酶標儀下觀察相對熒光峰值的變化，來測定內質網(wǎng)中總鈣離子濃度的而經(jīng)典的技術方法。該技術經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種活體細胞（動物、人體等）內內質網(wǎng)鈣離子的濃度檢測。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，檢測敏感。

技術背景

鈣是人體中的一種重要電介質和礦物質，占1150克。其中99％的鈣以氟磷灰石鈣（calcium fluorophosphate apatite）形式存在于骨組織中。非骨組織鈣成分主要存在于細胞內。鈣具有兩種主要形式：一種是非彌散型蛋白結合鈣，其構成約40％至50％的血清中的總鈣含量；另一種為彌散型游離鈣，其進一步分成具有活性的復合鈣（complexed calcium）和離子鈣（ionized calcium）。鈣對神經(jīng)肌肉興奮性（neuromuscular excitability）、血液凝固、酶的激活、離子跨膜運輸、釋放神經(jīng)傳導介質、信使傳導等方面起著重要作用。在細胞內，鈣離子主要儲存在線粒體和內質網(wǎng)等細胞器中。其中內質網(wǎng)鈣離子儲存在控制細胞活化、調控信號通路、蛋白分子轉錄后修飾，維持細胞內環(huán)境鈣離子平衡方面起著重要作用。內質網(wǎng)鈣的檢測包括沉淀法、EDTA鰲合滴定法、火焰光度法（flame photometry）、原子吸收分光光度法等技術，但容易受到鈉、鉀、磷酸鹽、硫酸鹽的干擾，或者受限于儀器的特殊的要求，以及需要內質網(wǎng)純化。Mag-Fluo-AM染料是一種鈣離子低親和性的熒光標記染料，特異性地由內質網(wǎng)捕獲，可以檢測內質網(wǎng)內的游離鈣離子濃度的變化。在熒光酶標儀下，激發(fā)波長490nm，散發(fā)波長525nm，來定量測定內質網(wǎng)的鈣濃度。

產品內容

 清理液（Reagent A）      40毫升

 染色液（Reagent B） 30微升

 介導液（Reagent C）     600微升

 通透液（Reagent D）     120微升

 飽和液（Reagent E）       2毫升

 陰性液（Reagent F）       2毫升

產品說明書     1份

保存方式

保存 清理液（Reagent A）、 染色液（Reagent B）、 介導液（Reagent C）和 通透液（Reagent D）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于工作液配制的容器

細胞培養(yǎng)箱：用于染色孵育

黑色96孔板：用于樣品操作的容器

熒光酶標儀：用于熒光分析

（共聚焦）熒光顯微鏡：用于熒光染色觀察

實驗步驟

• 測定準備

• 設定好熒光酶標儀（22℃）：激發(fā)波長490nm，散發(fā)波長525nm
• 測定開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的 染色液（Reagent B）室溫下融化，然后分別移出30微升 介導液（Reagent C）和1.5微升 染色液（Reagent B）到新的1.5毫升離心管，標記為 染色工作液，并放在暗室里備用。然后進行下列操作。 

二、熒光酶標儀檢測

• 準備1個黑色96孔板，標記為：細胞樣品孔、空白對照孔（不含細胞）、zui大對照孔（含細胞）
• 小心抽去細胞樣品孔的培養(yǎng)液
• 小心加入200微升  清理液（Reagent A） 
• 小心抽去清理液
• 小心加入100微升  清理液（Reagent A）
• 小心加入10微升 染色工作液
• 室溫下孵育60分鐘，避免光照
• 小心抽去染色液
• 加入200微升 清理液（Reagent A） 
• 加入2微升 通透液（Reagent D）
• 放進37℃培養(yǎng)箱，孵育4分鐘（注意：這一步驟決定zui大內質網(wǎng)鈣池濃度讀數(shù)）
• 小心抽去含有 通透液（Reagent D）的清理液；同時抽去zui大對照孔（含細胞）的培養(yǎng)液
• 加入100微升 清理液（Reagent A）到細胞樣品孔里
• 加入100微升 飽和液（Reagent E）到zui大對照孔里
• 加入100微升 陰性液（Reagent F）到空白對照孔里
• 分別加入10微升 染色工作液到zui大對照孔和空白對照孔里
• 輕輕搖動黑色96孔板，混勻
• 室溫下孵育10分鐘，避免光照
• 即刻放進熒光酶標儀測讀：獲得相對熒光單位（relative fluorescence unit；RFU） 
• 計算樣品內質網(wǎng)鈣離子濃度

【（樣品RFU－空白對照孔RFU）÷（zui大對照孔RFU－樣品RFU）】X 22（微摩爾；解離常數(shù)）

三、（共聚焦）或熒光顯微鏡檢測

1． 準備1個待測的細胞爬片樣品

• 小心加上500微升 清理液（Reagent A），覆蓋樣品表面
• 小心移去樣品上的 清理液（Reagent A）
• 移取300微升 清理液（Reagent A）到新的1.5毫升離心管
• 加入30微升 染色工作液，混勻 
• 小心加上上述 染色工作液到樣品上，覆蓋樣品表面
• 室溫下孵育60分鐘，避免光照
• 小心移去染色液
• 小心加上200微升 清理液（Reagent A） 
• 小心加上2微升 通透液（Reagent D）
• 放進37℃培養(yǎng)箱，孵育4分鐘
• 小心移去通透液
• 小心加上500微升新鮮的 清理液（Reagent A）
• 小心移去 清理液（Reagent A）
• 小心加上100微升新鮮的 清理液（Reagent A）
• 蓋上蓋玻片
• 即刻在（共聚焦）熒光顯微鏡下進行觀察：激發(fā)波長490nm，散發(fā)波長525nm（內質網(wǎng)鈣離子呈現(xiàn)綠色）

注意事項

• 本產品為20次操作
• 操作時，須戴手套
• 避免使用EDTA等處理樣品
• 孵育反應完成后即刻進行熒光測定
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度
• 檢測敏感度可達納摩爾級鈣濃度范圍
• 如果熒光淬滅敏感，建議使用 抗淬滅劑I-GMS12058.2）
• 可以使用熒光分光光度儀檢測
• 本公司提供系列鈣生化檢測試劑產品

質量標準

• 本產品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產品經(jīng)鑒定檢測敏感