MB10135.2 v.A

   冰凍切片氧化應(yīng)激活性氧次氯酸離子熒光測(cè)定試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)（中文版）

主要用途

   冰凍切片氧化應(yīng)激活性氧次氯酸離子熒光測(cè)定試劑盒是一種旨在通過(guò)透膜熒光染色劑氨苯基熒光素，與細(xì)胞內(nèi)次氯酸陰離子的反應(yīng)，產(chǎn)生綠色熒光，來(lái)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)次氯酸活性氧族的生成和增加的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。適宜于冰凍動(dòng)物組織的次氯酸陰離子分析。可以被用于細(xì)胞凋亡、信號(hào)傳遞、衰老、代謝和營(yíng)養(yǎng)學(xué)等的研究。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)易，活體檢測(cè)，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

超氧自由基陰離子（superoxide radical；O2^-）、過(guò)氧化氫（hydrogen peroxide；H2O2）、羥自由基或氫氧基（hydroxyl radical；OH^-）、過(guò)氧化基（peroxyl radical；ROO^-）、氫過(guò)氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO^-）、過(guò)氧亞硝基陰離子（peroxynitrite anion；ONOO^-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、單線(xiàn)態(tài)氧氣（singlet oxygen）等細(xì)胞內(nèi)活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的產(chǎn)生和增多，將導(dǎo)致細(xì)胞衰老或凋亡。次氯酸陰離子與細(xì)胞膜成分反應(yīng)，氧化質(zhì)膜上氫硫基團(tuán)，通過(guò)胺和不飽和脂肪酸的氯離子化和破壞鐵硫中心，達(dá)到干擾細(xì)胞功能，包括葡萄糖和氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和鉀泵能力。氨苯基熒光素（Aminophenyl fluorescein；2-[6-(4’-Amino) phenoxy-3H-xanthen-3-on-9-yl]benzoic acid；APF）是一種*自由通過(guò)細(xì)胞膜的熒光染色劑，選擇性與次氯酸陰離子反應(yīng)，生成強(qiáng)烈熒光的熒光素（fluorescein），同時(shí)在羥苯基熒光素（Hydroxyphenyl fluorescein；2-[6-(4’-Hydroxy) phenoxy-3H-xanthen-3-on-9-yl]benzoic acid；HPF）的對(duì)比存在下，排除其它活性氧族的干擾。據(jù)此證明組織細(xì)胞內(nèi)次氯酸活性氧族的存在。 

產(chǎn)品內(nèi)容

   清理液（Reagent A）     20毫升

   染色液（Reagent B）     50微升

   本底液（Reagent C）     50微升

   稀釋液（Reagent D）     20毫升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū) 1份

保存方式

保存   染色液（Reagent B）和   本底液（Reagent C）在－20℃冰箱里，嚴(yán)格避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；有效保證6月

用戶(hù)自備

1.5毫升離心管：用于細(xì)胞染色的容器

培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)孵育

（共聚焦）熒光顯微鏡：用于觀察熒光細(xì)胞

實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的   染色液（Reagent B）和   本底液（Reagent C）置入冰槽里融化，   稀釋液（Reagent D）放進(jìn)37℃恒溫水槽里預(yù)熱。然后移出5微升   染色液（Reagent B）到新的1.5毫升離心管，加入995微升   稀釋液（Reagent D），混勻后，標(biāo)記為   染色工作液，置入暗室里；同時(shí)移出5微升   本底液（Reagent C）到新的1.5毫升離心管，加入995微升   稀釋液（Reagent D），混勻后，標(biāo)記為   本底工作液，置入暗室里。然后進(jìn)行下列操作。

• 準(zhǔn)備2片同一切面厚為10微米的未經(jīng)固著處理的待測(cè)冰凍切片：標(biāo)記為樣本和本底
• 置于室溫下，分別小心加上500微升預(yù)冷的   清理液（Reagent A），鋪滿(mǎn)整個(gè)切片表面
• 分別小心移去切片上的   清理液（Reagent A）
• 小心加上500微升室溫預(yù)熱的   染色工作液到樣本切片上，鋪滿(mǎn)整個(gè)切片表面
• 小心加上500微升室溫預(yù)熱的   本底工作液到本底切片上，鋪滿(mǎn)整個(gè)切片表面
• 在37℃濕潤(rùn)培養(yǎng)箱里，孵育30分鐘，避免光照（注意：避免液體蒸發(fā)）
• 分別小心移去切片上的   染色工作液和   本底工作液
• 分別小心加上500微升   清理液（Reagent A），鋪滿(mǎn)整個(gè)切片表面
• 分別小心移去切片上的   清理液（Reagent A）
• 放上蓋玻片或封片
• 即刻在（共聚焦）熒光顯微鏡下觀察：激發(fā)波長(zhǎng)499nm，散發(fā)波長(zhǎng)515nm――（樣本綠色熒光—本底綠色熒光）增強(qiáng)，表明次氯酸陰離子含量高

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為20次操作
• 建議使用新鮮組織（手術(shù)切除后1小時(shí)內(nèi)）制成的冰凍切片
• 操作時(shí)，須戴手套
•    染色工作液和   本底工作液，避免光照
• 孵育時(shí)，須避免光照
• 建議組織染色完成后，即刻進(jìn)行熒光定性分析
• 根據(jù)細(xì)胞類(lèi)型，同步調(diào)整   染色工作液和   本底工作液使用劑量（1：200至1：1000容量比），避免過(guò)度染色
• 如果次氯酸陰離子濃度過(guò)低，可以延長(zhǎng)孵育時(shí)間至60分鐘
• 激發(fā)波長(zhǎng)可以選擇在485至500nm，散發(fā)波長(zhǎng)505至550nm之間的任一波長(zhǎng)
• 本公司同時(shí)提供系列次氯酸活性氧檢測(cè)試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定熒光清晰