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PCR操作范例及反應體系的組成

來源:上海士鋒生物科技有限公司   2017年08月14日 07:55  


一、PCR操作范例
在一個典型的pcr反應體系中需加入:適宜的緩沖液、微量的模板DNA、4×dNTPs、耐熱性多聚酶、Mg2+和兩個合成的DNA引物。模板DNa 94℃變性1min,引物與模板40~60℃退火1min,72℃延伸2min。在循環(huán)前模板預變性3~5min;在末次循環(huán)后,樣品仍需繼續(xù)延伸3~5min以上,確保擴增的DNA為雙鏈DNA。為便于了解PCR反應中各成份的組成,加入量和反應條件,使人們以此為基礎,對不同的研究對象逐項改變來找到*反應條件,特列舉Perkin Elmer Cetus公司Gene Amp DNA試劑盒提供的典型反應條件供參考。

表22-1 PCR反應混合液

成分

加入體積(μl)

zui終濃度

雙蒸餾水

53.5

 

10×反應緩沖液[1]

10.0

[1×]Mg2+1.5mmol/l K+50mmol/L

4×dNTPs(各1.25mmol/L)

16.0

各200μmol/L

λ-DNA模板(全長48.5kD)

10.0

1ng/次

引物1,2(各25bp,20μmol/L)[3,4]

5.0

1.0μmol/L(100pmol)

Taq聚合酶儲存液[2]

0.5

2U/100μl

總體積(pH8.3)

100.0

 

石蠟油

50~100.0

 

擴增條件:94℃60s,37℃60s,72℃120s,共25~30個循環(huán)。

注:[1]反應緩沖液[10×]含:100mmol/l Tris-HCl pH8.3(25℃),

15mmol/L KCl, 15mmol/L MgCl2,

0.01%(W/V)明膠(Sigma G2500)

[2]酶儲存緩沖液(-20℃)含:50%甘油,100mmol/l KCl,

20mmol/L Tris-HCl ph8.0

0.1mmol/L EDTA, 1.0mmol/L DTT

200μg/ml明膠

0.5%吐溫20,0.5% Nonidet P40

[3][4]引物,1,2:擴增λ-噬菌體基因中500bp的片段

引物1序列:7131~7155(5’)-GATGAGTTCGTGTCCGTACAACTGG-(3’)

引物2序列:7606~7630(5’)-GGTTATCGAAATCAGCCACAGCGCC-(3’)

注意(3’)端有2個bp互補故易生成50bp的雙體

二、PCR反應系統(tǒng)的組成

(一)PCR緩沖液(PCr Buffer)

用于PCR的標準緩沖液見PCR操作范例。于72℃時,反應體系的pH值將下降1個單位,接近于7.2。二價陽離子的存在至關重要,影響PCR的特異性和產(chǎn)量。實驗表明,Mg2+優(yōu)于Mn2+,而Ca2+無任何作用。

1.Mg2+濃度Mg2+的*濃度為1.5mmol/L(當各種dNTP濃度為200mmol/L時),但并非對任何一種模板與引物的結合都是*的。使用靶序列和引物結合時,都要把Mg2+濃度調到*,其濃度變化范圍為1~10mmol/L。Mg2+過量易生成非特異性擴增產(chǎn)物,Mg2+不足易使產(chǎn)量降低。

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