動(dòng)物細(xì)胞膜性囊泡（RSOV和IOV）制備試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)（中文版）

主要用途

 動(dòng)物細(xì)胞膜性囊泡（RSOV和IOV）制備試劑是一種旨在通過(guò)差速離心技術(shù)從動(dòng)物細(xì)胞中分離出各種正常外向膜性囊泡（Right-side out；RSOV）和內(nèi)側(cè)外翻膜性囊泡（In-side out；IOV）組分的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。適合于各種動(dòng)物、人體細(xì)胞的膜性囊泡的制備。其制備物產(chǎn)量高，可以被用于膜通道、信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制、膜蛋白分布等研究。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶，即到即用，性能穩(wěn)定，分離產(chǎn)量和純度俱佳。

技術(shù)背景

膜性囊泡（membrane vesicle）分成正常外向膜性囊泡（Right-side out；RSOV）和內(nèi)側(cè)外翻膜性囊泡（In-side out；IOV）。正常外向膜性囊泡是通過(guò)去除細(xì)胞漿內(nèi)容物，使之失去細(xì)胞內(nèi)在的代謝系統(tǒng)，同時(shí)保持質(zhì)膜的原始位相，有利于提供適合的底物，不會(huì)受到降解和代謝，建立動(dòng)力機(jī)制，進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)或攝入研究，例如微粒體組分用于V型ATP酶研究、線粒體組分用于F型ATP酶研究。而內(nèi)側(cè)外翻膜性囊泡是通過(guò)裂解細(xì)胞和細(xì)胞器后，質(zhì)膜重新閉合形成內(nèi)側(cè)面外翻的囊泡狀結(jié)構(gòu)，廣泛用于原發(fā)性轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的研究。 

產(chǎn)品內(nèi)容

 清理液（Reagent A）    200毫升

 平衡液（Reagent B）     60毫升

 保存液（Reagent C）     20毫升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)   1份

保存方式

保存 保存液（Reagent C）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；有效保證6月

用戶(hù)自備

HANK平衡鹽緩沖溶液（GMS12028）或PBS緩沖溶液（GMS12033）：用于清理細(xì)胞

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（GMS12024）：用于細(xì)胞脫離

*細(xì)胞培養(yǎng)液（GMS12052）：用于細(xì)胞處理所需的培養(yǎng)基

50毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于樣品操作和保存的容器

4℃超速離心機(jī)：用于分離膜性囊泡

DOUNCE勻漿器：用于裂解細(xì)胞

實(shí)驗(yàn)步驟

一、正常外向膜性囊泡分離（線粒體和微粒體）

• 準(zhǔn)備5至10瓶75cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶的細(xì)胞（5 X 10⁷），直至細(xì)胞生長(zhǎng)鋪滿(mǎn)整個(gè)培養(yǎng)表面
• 分別加入10毫升用戶(hù)自備的HANK平衡鹽緩沖溶液或PBS緩沖溶液到每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶，覆蓋培養(yǎng)瓶表面，然后抽去
• 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟2一次
• 加入3毫升用戶(hù)自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿(mǎn)整個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)表面
• 置入37℃培養(yǎng)箱3分種
• 輕輕手擊震動(dòng)培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞脫落，
• 分別加入10毫升用戶(hù)自備的*細(xì)胞培養(yǎng)液
• 移入一個(gè)50毫升錐形離心管
• 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為200g
• 小心抽去上清液
• 加入10毫升預(yù)冷的 清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞
• 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入3毫升預(yù)冷的 平衡液（Reagent B）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 即刻放入預(yù)冷的DOUNCE勻漿器
• 在冰槽里用研磨棒勻化細(xì)胞（約80下）
• 將所有細(xì)胞勻漿物移入15毫升錐形離心管
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1000g
• 小心移出上清液到另一個(gè)新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g
• 小心移出上清液到2個(gè)新的1.5毫升離心管，同時(shí)保留沉淀顆粒
• 加入500微升 保存液（Reagent C）到沉淀顆粒管――此為線粒體RSOV組分（注意：可用于F型ATP酶研究）
• 將含有上清液的2個(gè)1.5毫升離心管放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心60分鐘，速度為100000g
• 小心抽去上清液
• 分別加入500微升 保存液（Reagent C）――此為微粒體RSOV組分（注意：可用于V型ATP酶研究）
• 移取10微升進(jìn)行蛋白質(zhì)定量測(cè)定（注意：建議使用  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）
• 即刻放進(jìn)－70℃冰箱里保存

二、內(nèi)側(cè)外翻膜性囊泡分離（質(zhì)膜分離）

• 準(zhǔn)備5至10瓶75cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶的細(xì)胞（5 X 10⁷），直至細(xì)胞生長(zhǎng)鋪滿(mǎn)整個(gè)培養(yǎng)表面
• 分別加入10毫升用戶(hù)自備的HANK平衡鹽緩沖溶液或PBS緩沖溶液到每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶，覆蓋培養(yǎng)瓶表面，然后抽去
• 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟2一次
• 加入3毫升用戶(hù)自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿(mǎn)整個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)表面
• 置入37℃培養(yǎng)箱3分種
• 輕輕手擊震動(dòng)培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞脫落，
• 分別加入10毫升用戶(hù)自備的*細(xì)胞培養(yǎng)液
• 移入一個(gè)50毫升錐形離心管
• 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為200g
• 小心抽去上清液
• 加入10毫升預(yù)冷的 清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞
• 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入3毫升預(yù)冷的 平衡液（Reagent B）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 即刻放入預(yù)冷的DOUNCE勻漿器
• 在冰槽里用研磨棒勻化細(xì)胞（約80下）
• 將所有細(xì)胞勻漿物移入15毫升錐形離心管
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1000g
• 小心移出上清液到另一個(gè)新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心30分鐘，速度為10000g
• 小心抽去上清液
• 加入500微升 保存液（Reagent C）――此為質(zhì)膜RSOV組分（注意：可用于P型ATP酶研究）
• 連續(xù)－70℃至37℃凍融4次――此為質(zhì)膜IOV組分
• 移取10微升進(jìn)行蛋白質(zhì)定量測(cè)定（注意：建議使用  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）
• 即刻放進(jìn)－70℃冰箱里保存
• （選擇步驟）進(jìn)行IOV組分純化（建議使用  IOV膜性囊泡高質(zhì)純化試劑盒－GMS10170）

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為20次（5 X 10⁷動(dòng)物細(xì)胞）操作
• 所有操作均須在4℃或以下?tīng)顟B(tài)進(jìn)行
• 建議使用足夠的樣品量
• 通常5 X 10⁷動(dòng)物細(xì)胞的微粒體組分含量為50毫克蛋白，線粒體組分含量5毫克蛋白，100毫克質(zhì)膜

5． 質(zhì)膜IOV組分為粗提分離產(chǎn)物，其中含有RSOV和未予閉合的質(zhì)膜不等，如果需要獲得95％以上的高純度的IOV，建議使用  IOV膜性囊泡高質(zhì)純化試劑盒－GMS10170

6． 純化的樣品避免反復(fù)凍融  

• 本公司提供系列離子膜通道轉(zhuǎn)運(yùn)功能（transport/uptake）分析試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定分離組分維持正常活性
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定不含污染性蛋白酶和核酶