精子細(xì)胞氧化應(yīng)激活性氧（ROS）NBT比色法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說明書

（中文版）

主要用途

 精子細(xì)胞氧化應(yīng)激活性氧（ROS）NBT比色法定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過硝基藍(lán)四氮唑染料，受到超氧陰離子O₂^-的還原，產(chǎn)生不溶性藍(lán)黑色色素沉淀，由分光光度儀比色分析，定量檢測(cè)精子細(xì)胞內(nèi)活性氧族的生成和增加的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。適用于動(dòng)物和人體精子細(xì)胞的活性氧族的檢測(cè)。可以被用于細(xì)胞凋亡、衰老、代謝和營養(yǎng)學(xué)，以及發(fā)育生物學(xué)（男性不育）等的研究。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定，顯色清晰。

技術(shù)背景

超氧自由基陰離子（superoxide radical；O2^-）、過氧化氫（hydrogen peroxide；H2O2）、羥自由基或氫氧基（hydroxyl radical；OH^-）、過氧化基（peroxyl radical；ROO^-）、氫過氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO^-）、過氧亞硝基陰離子（peroxynitrite anion；ONOO^-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、單線態(tài)氧氣（singlet oxygen）等細(xì)胞內(nèi)活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的產(chǎn)生和增多，甚而導(dǎo)致諸如男性不育、冠心病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腫瘤、退行性病變等各種病理狀況。其中精子細(xì)胞（spermatozoa）對(duì)于活性氧較為敏感：低濃度活性氧可以調(diào)節(jié)正常精子功能、精子獲能、頂體反應(yīng)、精卵融合等；高濃度活性氧則影響精子細(xì)胞的質(zhì)量和功能，因?yàn)榫蛹?xì)胞質(zhì)膜含有大量不飽和脂肪酸，胞漿含有少量的祛除活性氧的相關(guān)酶蛋白，由此活性氧容易造成精子質(zhì)膜的流動(dòng)性和DNA完整性受到損害，精子運(yùn)動(dòng)能力降低，不能參與授精活動(dòng)，zui終導(dǎo)致特發(fā)性不育癥（idiopathic infertility）。染料四氮唑蘭（tetrazolium）化合物，硝基藍(lán)四氮唑（Nitro Blue Tetrazolium；NBT），是一種黃色水溶性硝基替代性芳香族四氮唑化合物，與細(xì)胞內(nèi)超氧陰離子O₂^-反應(yīng)而被直接還原，產(chǎn)生不溶性甲暨色素，在分光光度儀下（650nm波長），呈現(xiàn)吸光峰值的變化。據(jù)此定量檢測(cè)精子細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激活性氧族的濃度。

產(chǎn)品內(nèi)容

 清理液（Reagent A）    500毫升

 染色液（Reagent B）      1瓶

 溶解液（Reagent C）     10毫升

產(chǎn)品說明書 1份

保存方式

保存 染色液（Reagent B）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；有效保證6月

用戶自備

2毫升離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品操作

細(xì)胞培養(yǎng)箱：用于精子細(xì)胞染色孵育

96孔板：用于比色分析的容器

酶標(biāo)儀：用于比色分析

實(shí)驗(yàn)步驟

• 樣品預(yù)處理

• 移取2毫升新鮮收集（1小時(shí)內(nèi)）的精液到2毫升離心管
• 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱孵育20分鐘
• 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心7分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入2毫升 清理液（Reagent A），混勻精子細(xì)胞顆粒群
• 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心7分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入適量的 清理液（Reagent A）
• 充分混勻后，在血細(xì)胞計(jì)數(shù)器上進(jìn)行精子細(xì)胞計(jì)數(shù)
• 調(diào)整精子細(xì)胞數(shù)為1 X 10⁷/毫升
• 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱里備用（1小時(shí)內(nèi)）

• 樣品檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)開始前，移出10毫升 清理液（Reagent A）到1瓶 染色液（Reagent B）瓶里，混勻后，標(biāo)記為 染色工作液，置于冰槽里備用（注意，用完后即刻放回－20℃冰箱里）。然后進(jìn)行下列操作。

• 移取100微升上述預(yù)處理的精子細(xì)胞到1.5毫升離心管
• 加入100微升 染色工作液，混勻
• 放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育45分鐘
• 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為500g
• 小心抽去上清液
• 加入500微升 清理液（Reagent A）
• 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為500g
• 小心抽去清理液
• 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟6至8一次
• 加入100微升 溶解液（Reagent C），混勻

11． 在室溫下，孵育5分鐘

12． 即刻轉(zhuǎn)移到96孔板

13． 放進(jìn)酶標(biāo)儀測(cè)讀，波長為650 nm

• 構(gòu)建精子細(xì)胞內(nèi)活性氧生成曲線：縱座標(biāo)（Y軸）為活性氧吸光值（OD）；橫坐標(biāo)（X軸）為細(xì)胞數(shù)、時(shí)間點(diǎn)或藥物處理濃度等
• 或計(jì)算ROS水平：

（樣品讀數(shù)－本底讀數(shù)） ÷ 0.1（毫升；樣品容量） ＝吸光單位（OD） / 毫升＝吸光單位（OD）/1 X 10⁷精子細(xì)胞 

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為100次（96孔板）操作
• 操作時(shí)，須戴手套
• 孵育時(shí)，須避免光照
• 測(cè)試前，精子細(xì)胞須新鮮收集，1小時(shí)內(nèi)為*
• 精子細(xì)胞懸液制備后即刻測(cè)讀，不宜過夜保存
• 精子細(xì)胞懸液須清澈
• 如果需要排除精液白細(xì)胞的干擾，建議純化精子細(xì)胞： 精子細(xì)胞高純分離試劑盒（GMS14003）
• 如果需要區(qū)分精液各種成分的活性氧生成情況，建議使用 精漿（seminal plasma）氧化應(yīng)激活性氧（ROS）NBT比色法定量檢測(cè)試劑盒（GMS14007.2）
• 本產(chǎn)品適合凍存的精子細(xì)胞檢測(cè)
• 如果活性氧濃度過低，可以延長孵育時(shí)間至2小時(shí)
• 本公司提供系列精子細(xì)胞分析試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感