[器材和試劑]

●  PCR試劑和設(shè)備

●  含有起始scFv的pHENl質(zhì)粒或單鏈DNA（ssDNA）

●  Wlzard PCR純化試劑盒（PrOli]egs.）

●  PdSEQl引物

●  定制BACK引物。本實(shí)驗(yàn)方案中，該引物是scFvVlBACK引物：5'-AGC GCC GTG TAT TTT TGC    GCG CGA CAT GAC GTG GGA TAT TGC-3'

●  用于scFv基因文庫(kù)限制性消化的試劑和設(shè)備

●  BssHⅡ限制性酶（NEB）

●  用于連接scFv和pHENl DNA以及將scFv文庫(kù)電轉(zhuǎn)化到大腸桿菌的試劑和設(shè)備

●   來(lái)自3個(gè)VH基因片段噬菌體文庫(kù)的質(zhì)粒DNA

[方法]

1. 配制50ul PCR反應(yīng)混合液，包含：

●  水，34.5ul

●  20×dNTP（每種5mmol/L）。  2.5ul

●  10×Vent聚合酶緩沖液，5.0ul

●  FdSEQl引物（10pmol/u1），2.5ul

●  scFvVLBACK引物（1opmol/u1），2.5/ul

●  scFv模板DNA（50ng/ul），  2.0ul

●  VentDNA聚合酶（2單位），1.0ul

2. 在有加熱蓋的熱循環(huán)儀內(nèi)加熱反應(yīng)物到94℃5分針。

3. 以94℃30秒、42℃30秒、72℃1分鐘的條件共循環(huán)25次，擴(kuò)增VH基因。

4. 用Wizard PCR純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物。

5. 用BssHⅡ和NotI消化PCR產(chǎn)物。  由于用BssHⅡ替代了NcoI，因此實(shí)驗(yàn)方案需要調(diào)整：首先在37℃用NotI消化，再加入BssHⅡ并調(diào)整溫度至50℃。

6, 制備受方VH基因片段文庫(kù)載體；但用BssHⅡ/NotI消化載體，應(yīng)按上述步驟5進(jìn)行調(diào)整。

7. 連接已消化的VL基因片段PCR產(chǎn)物和已消化的VH基因片段噬菌體文庫(kù)載體，并電轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TGl中，構(gòu)建重鏈改組文庫(kù)。