概述

校準(zhǔn)曲線包括標(biāo)準(zhǔn)曲線和工作曲線，前者用標(biāo)準(zhǔn)溶液系列直接測(cè)量，沒(méi)有經(jīng)過(guò)預(yù)處理過(guò)程，這對(duì)于樣品往往造成較大誤差；而后者所使用的標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)過(guò)了與樣品相同的消解、凈化、測(cè)量等全過(guò)程。

凡應(yīng)用校準(zhǔn)曲線的分析方法，都是在樣品測(cè)得信號(hào)值后，從校準(zhǔn)曲線上查得其含量（或濃度）。因此，繪制準(zhǔn)確的校準(zhǔn)曲線，直接影響到樣品分析結(jié)果的準(zhǔn)確與否。此外，校準(zhǔn)曲線也確定了方法的測(cè)定范圍。

一、如何正確繪制校準(zhǔn)曲線

用一系列被測(cè)物標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照標(biāo)準(zhǔn)方法規(guī)定的步驟，將被測(cè)物轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩芤?，制備好的?biāo)準(zhǔn)系列和空白，在方法選定的波長(zhǎng)下，測(cè)定吸光度。已被測(cè)物濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制校準(zhǔn)曲線。

步驟：

1）對(duì)標(biāo)準(zhǔn)系列，溶液以純?nèi)軇閰⒈冗M(jìn)行測(cè)量后，應(yīng)先作空白校正，然后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；

2）標(biāo)準(zhǔn)溶液一般可直接測(cè)定，但如試樣的預(yù)處理較復(fù)雜致使污染或損失不可忽略時(shí)，應(yīng)和試樣同樣處理后再測(cè)定；

3）校準(zhǔn)曲線的斜率常隨環(huán)境溫度、試劑批號(hào)和貯存時(shí)間等實(shí)驗(yàn)條件的改變而變動(dòng)。因此，在測(cè)定試樣的同時(shí)，繪制校準(zhǔn)曲線zui為理想。否則，應(yīng)在測(cè)定試樣的同時(shí)，平行測(cè)定零濃度和中等濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液各兩份，取均值相減后與原校準(zhǔn)曲線上的相應(yīng)點(diǎn)核對(duì)。其相對(duì)差值根據(jù)方法精密度不得大于5%～10%，否則，應(yīng)重新繪制校準(zhǔn)曲線；

二、如何檢驗(yàn)校準(zhǔn)曲線

1）線性檢驗(yàn)

即檢驗(yàn)校準(zhǔn)曲線的精密度，對(duì)于以4～6個(gè)濃度單位所獲得的測(cè)量信號(hào)值繪制的校準(zhǔn)曲線，分光光度法一般要求其相關(guān)系數(shù)|r|≥0.9990，否則應(yīng)找出原因并加以糾正，重新繪制合格的校準(zhǔn)曲線。

2）截距檢驗(yàn)

即檢驗(yàn)校準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)確度，在線性檢驗(yàn)合格的基礎(chǔ)上，對(duì)其進(jìn)行線性回歸，得出回歸方程y=a+bx，然后，將所得截距a與0作t檢驗(yàn)，當(dāng)取95%置信水平，經(jīng)檢驗(yàn)無(wú)顯著性差異時(shí)，a可做0處理，方程簡(jiǎn)化為y=bx，移項(xiàng)得x=y/b。在線性范圍內(nèi)，可代替查閱校準(zhǔn)曲線，直接將樣品測(cè)量信號(hào)值經(jīng)空白校正后，計(jì)算出試樣濃度。

當(dāng)a與0有顯著性差異時(shí)，表示校準(zhǔn)曲線的回歸方程計(jì)算結(jié)果準(zhǔn)確度不高，應(yīng)找出原因予以校正后，重新繪制校準(zhǔn)曲線并經(jīng)線性檢驗(yàn)合格。在計(jì)算回歸方程，經(jīng)截距檢驗(yàn)合格后投入使用。回歸方程如不經(jīng)上述檢驗(yàn)和處理，就直接投入使用，必將給測(cè)定結(jié)果引入差值相當(dāng)于解決a的系統(tǒng)誤差。

3）斜率檢驗(yàn)

即檢驗(yàn)分析方法的靈敏度，方法靈敏度是隨實(shí)驗(yàn)條件的變化而改變的，在*相同的分析條件下，僅由于操作中的隨機(jī)誤差導(dǎo)致的斜率變化不應(yīng)超出一定的允許范圍，此范圍因分析方法的精度不同而異，例如，一般而言，分子吸收分光光度法要求其相對(duì)差值小于5%，而原子吸收分光光度法則要求其相對(duì)差值小于10%等。

三、如何正確的控制校準(zhǔn)曲線

被測(cè)物轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩芤旱姆磻?yīng)稱(chēng)為顯色反應(yīng)或發(fā)色反應(yīng)，顯色反應(yīng)介質(zhì)的pH條件、顯色劑用量、顯色反應(yīng)的時(shí)間和溫度、為消除共存物干擾而加入的掩蔽劑、甚至加試劑的順序，都要按照方法步驟的要求執(zhí)行。有時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)系列雖然不像實(shí)際試樣那樣組成復(fù)雜，但仍要求與試樣進(jìn)行同樣的處理步驟，以便控制校準(zhǔn)曲線上的數(shù)據(jù)點(diǎn)的空白、回收率等因素。

建立校準(zhǔn)曲線時(shí)，測(cè)量吸光度的參比有兩種選擇：

*種方法用純?nèi)軇┳鲄⒈?，兩個(gè)比色皿都放溶劑時(shí)，“樣品比色皿”的吸光度測(cè)定值為比色皿成對(duì)性校正值。此后，所有樣品吸光度測(cè)定值都須扣除此值，進(jìn)行校正，然后，以純?nèi)軇閰⒈?，測(cè)定空白及標(biāo)準(zhǔn)系列的吸光度，繪制校準(zhǔn)曲線。

第二種方法直接用空白為參比，當(dāng)兩個(gè)比色皿都放空白時(shí)，測(cè)定比色皿成對(duì)性校正值，然后，測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)系列的吸光度，繪制校準(zhǔn)曲線。兩種方法得到的兩條校準(zhǔn)曲線互相平行，但*種方法可測(cè)定空白的水平，后一種方法不能測(cè)定空白，理論上校準(zhǔn)曲線通過(guò)原點(diǎn)。若空白為零，兩條校準(zhǔn)曲線重合。無(wú)論用什么作參比，實(shí)樣測(cè)定時(shí)應(yīng)該使用與建立校準(zhǔn)曲線相同的比色皿和同樣的參比。比色皿的成對(duì)性校正對(duì)于使用已久的比色皿有必要，尤其是測(cè)量吸光度很小的樣品時(shí)，校正可保證測(cè)量值的可靠性和重復(fù)性。

小結(jié)

    使用校準(zhǔn)曲線時(shí)應(yīng)注意：校準(zhǔn)曲線包括“標(biāo)準(zhǔn)曲線”和“工作曲線”。應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)溶液制作校準(zhǔn)曲線時(shí)，如果分析步驟與樣品的分析步驟相比有某些省略時(shí)，則制作的校準(zhǔn)曲線稱(chēng)為標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果模擬被分析物質(zhì)的成分，并與樣品*相同的分析處理，然后，繪制的校準(zhǔn)曲線稱(chēng)為工作曲線。因此，如果基體效應(yīng)對(duì)分析方法至關(guān)重要時(shí)，應(yīng)使用含有與實(shí)際樣品類(lèi)似基體的標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進(jìn)行校準(zhǔn)曲線繪制。

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