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芽孢染色試劑盒的原理及使用方法

來(lái)源:上海嵐興生物科技有限公司   2017年01月23日 09:12  

本篇文章由專業(yè)生化試劑供應(yīng)商上海嵐興生物為您提供。

 

芽孢又叫內(nèi)生孢子,通常為圓形或橢圓形,是芽孢桿菌屬和梭菌屬生長(zhǎng)到一定階段形成的一種抗逆性很強(qiáng)的體眠體結(jié)構(gòu)。芽孢染色可以用的染料很多,但是由于芽孢壁厚、透性低,所以著色、脫色均較困難。

芽孢染色原理

芽孢染色法是利用細(xì)菌的芽孢和菌體對(duì)染料的親合力不同的原理,用不同染料進(jìn)行著色,使芽孢和菌體呈不同的顏色而便于區(qū)別。一般芽孢染色時(shí)會(huì)選用弱堿性染料,如:如孔雀綠(malachite green)或堿性品紅(basicfuchsin)在加熱條件下進(jìn)行染色。染色時(shí)染料不僅可以進(jìn)入菌體,而且也可以進(jìn)入芽孢,進(jìn)入菌體的染料可經(jīng)水洗脫色,而進(jìn)入芽孢的染料則難以透出,若再用復(fù)染液(如番紅液)或襯托溶液(如黑色素溶液)處理,則菌體和芽孢易于區(qū)分。常用的芽孢染色法是孔雀石綠染色法,芽孢被染上青綠色,而菌體被番紅復(fù)染為紅色。

芽孢染色方法

方法1

(1)將培養(yǎng)24小時(shí)左右的枯草芽孢桿菌或其他芽孢桿菌,作涂片、干燥、固定。

(2)滴加3—5滴孔雀綠染液于已固定的涂片上。

(3)用木夾夾住載玻片在火焰上加熱,使染液冒蒸汽但勿沸騰,切忌使染液蒸干,必要時(shí)可添加少許染液。加熱時(shí)間從染液冒蒸汽時(shí)開(kāi)始計(jì)算約4-5分鐘。這一步也可不加熱,改用飽和的孔雀綠水溶液(約7.6%)染10分鐘。

(4)傾去染液,待玻片冷卻后水洗至孔雀綠不再褪色為止。

(5)用番紅水溶液復(fù)染1分鐘,水洗至水為無(wú)色。

(6)待干燥后,置油鏡觀察,芽孢呈綠色,菌體呈紅色。

注意事項(xiàng)

(1)選用適當(dāng)菌齡的菌種,幼齡菌尚未形成芽孢,而老齡菌芽孢囊已經(jīng)破裂。

(2)加熱染色時(shí)必須維持在染液冒蒸汽的狀態(tài),加熱沸騰會(huì)導(dǎo)致菌體或芽孢囊破裂,加熱不夠則芽孢難以著色。

方法2

(1)取二支潔凈的小試管,分別加入0.2ml無(wú)菌水,再往一管中加入1-2接種環(huán)的蠟狀芽孢桿菌的菌苔,另一管中加入1-2接種環(huán)的生孢梭菌的菌苔,兩管各自充分混合成濃厚的菌懸液。

(2)在菌懸液中分別加入0.2ml苯酚品溶液,充分混合后,于沸水浴中加熱3-5分鐘。

(3)用接種環(huán)分別取上述混合液2-3環(huán)于兩片載玻片上,涂薄,風(fēng)干后,將載玻片稍傾斜于燒杯上,用95%乙醇沖洗至無(wú)紅色液流出。

(4)再用自來(lái)水沖洗,濾紙吸干。

(5)取1—2接種環(huán)黑色素溶液于涂片處,立即展開(kāi)涂薄,自然干燥后,油鏡觀察,在淡紫灰色背景的襯托下,菌體為白色,菌體內(nèi)的芽孢為紅色。

芽孢染色注意事項(xiàng)

1.為了防止細(xì)菌體和孢子體熱脹冷縮過(guò)于劇烈而發(fā)生形變從而影響兩者之間形狀區(qū)別的觀察,芽孢染色時(shí)需要進(jìn)行加熱。

2.芽孢出現(xiàn)在微生物生長(zhǎng)曲線的衰亡期,剛菌齡較小的菌是不會(huì)產(chǎn)生芽孢的.而菌齡較老的細(xì)菌容易失落鞭毛,所以芽孢染色用的菌種要控制菌齡。

鏡檢怎樣區(qū)分芽孢死活,用什么染色劑

要區(qū)別芽孢死活用一般染色劑難以做到,芽孢本來(lái)就是休眠體,你想想休眠的動(dòng)物如蛇、青蛙、熊,你怎么區(qū)分他們是死是活?當(dāng)然是把他們放在合適的環(huán)境下,活的就會(huì)表現(xiàn)出活的跡象,比如呼吸、心跳...同理,在載玻片上芽孢區(qū)域滴上幾滴芽孢萌發(fā)劑,常見(jiàn)的有AGFK、L-丙氨酸、葡萄糖等,這個(gè)搜索到,查文獻(xiàn)亦可,置于30°培養(yǎng)箱30分鐘,然后鏡檢,能夠萌發(fā)成營(yíng)養(yǎng)體的就是有活性的芽孢,反之就是死的(但不排除萌發(fā)受體缺失突變的芽孢,自然情況下是很少出現(xiàn)的,一般科學(xué)研究中才會(huì)人為篩選出)。

上海嵐興生物科技為生化試劑供應(yīng)商,專業(yè)生產(chǎn)銷售生化試劑、生物試劑、細(xì)胞培養(yǎng)、試劑盒、實(shí)驗(yàn)耗材等產(chǎn)品。芽孢染色試劑盒利用芽胞具有高度的折光性,外膜致密,滲透性低,著色和脫色均較困難。在加熱條件下進(jìn)行染色時(shí),染料不僅進(jìn)入菌體也可進(jìn)入芽孢內(nèi),進(jìn)入菌體的染料可被酒精脫色,而芽胞上的染料仍保留,經(jīng)復(fù)染劑復(fù)染后,菌體和芽胞呈現(xiàn)出不同的顏色。

芽孢染色試劑盒使用步驟:

1、制作一適當(dāng)厚度的細(xì)菌涂片,自然干燥,通過(guò)火焰加熱固定。

2、滴加適量染色液 A 于涂片上,在酒精燈上加熱,使染液冒蒸汽但不沸騰。必要時(shí)可續(xù)加染液以免干涸。維持 4-5 分鐘。

3、待標(biāo)本冷卻后以 95%酒精脫色液沖洗至無(wú)紅色染液脫出為止,水洗。

4、滴加染色液 B 復(fù)染約 2-3 分鐘,水洗至無(wú)染液脫出為止。

5、待干后油鏡觀察。預(yù)期結(jié)果:菌體呈藍(lán)色,芽孢呈紅色。

注意事項(xiàng):

1.供芽孢染色用的培養(yǎng)物應(yīng)控制菌齡,要求大部分芽孢仍保留在菌體內(nèi)為宜。

2.加熱染色時(shí)必須維持在染液冒蒸汽的狀態(tài),加熱沸騰會(huì)導(dǎo)致菌體或芽孢囊破裂,加熱不夠則芽孢難以著色。

3.請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

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