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FISH技術(shù)通過(guò)熒光標(biāo)記的DNA探針與細(xì)胞核內(nèi)的DNA靶序列雜交。在熒光顯微鏡下觀察并分析細(xì)胞核內(nèi)雜交于DNA靶序列的探針信號(hào)，以獲得細(xì)胞核內(nèi)染色體(或染色體片段)上基因狀態(tài)的信息。目前進(jìn)行HER2基因狀態(tài)檢測(cè)的探針多為同時(shí)含有HER2基因和該基因所在的第17號(hào)染色體著絲粒(CEPl7)序列的雙探針，也可采用僅含有HER2基因的單探針。

1．觀察程序：應(yīng)在低倍鏡下觀察整張FISH切片，初步判斷檢測(cè)質(zhì)量以及是否存在HER2擴(kuò)增的異質(zhì)性。要求至少找到2個(gè)浸潤(rùn)癌區(qū)域，計(jì)數(shù)至少20個(gè)浸潤(rùn)癌細(xì)胞。也可以參照IHC切片先確定可能存在擴(kuò)增的浸潤(rùn)癌區(qū)域，然后于100倍物鏡下通過(guò)特異通道濾光片觀察HER2和CEP17信號(hào)，并進(jìn)行信號(hào)計(jì)數(shù)和比值計(jì)算。

2．結(jié)果判讀及注意事項(xiàng)：應(yīng)選擇細(xì)胞核大小一致、核的邊界完整、二脒基苯基吲哚(DAPI)染色均一、細(xì)胞核無(wú)重疊、信號(hào)清晰的細(xì)胞。隨機(jī)計(jì)數(shù)至少20個(gè)浸潤(rùn)癌細(xì)胞核中的雙色信號(hào)。在觀察信號(hào)時(shí)，應(yīng)根據(jù)情況隨時(shí)調(diào)節(jié)顯微鏡的焦距，準(zhǔn)確觀察位于細(xì)胞核不同平面上的信號(hào)以免遺漏。判讀標(biāo)準(zhǔn)如下圖--雙探針ISH：

(1)當(dāng)HER2／CEP17比值≥2.0時(shí)，為HER2陽(yáng)性；HER2／CEP17比值<2.0，但平均HER2拷貝數(shù)／細(xì)胞≥6.0時(shí)也為HER2陽(yáng)性。擴(kuò)增細(xì)胞應(yīng)均質(zhì)、連續(xù)，且占浸潤(rùn)癌的10％以上。需要注意的是對(duì)于HER2／CEP17比值≥2.0，但平均HER2拷貝數(shù)／細(xì)胞<4.0的病例是否應(yīng)該視為ISH陽(yáng)性目前尚存一定爭(zhēng)議。建議對(duì)這部分病例在報(bào)告中加以備注，提示目前的認(rèn)識(shí)爭(zhēng)議，建議臨床醫(yī)師參考IHC檢測(cè)結(jié)果并與患者進(jìn)行必要的溝通。

(2)HER2／CEPl7比值<2.0且平均HER2拷貝數(shù)／細(xì)胞<2.0時(shí)為HER2陰性。

(3)HER2／CEP17比值<2.0且平均HER2拷貝數(shù)／細(xì)胞<6.0，但i>4.0時(shí)為HER2 ISH結(jié)果不確定。單探針ISH：腫瘤細(xì)胞平均HER2拷貝數(shù)／細(xì)胞<4．0為無(wú)擴(kuò)增；腫瘤細(xì)胞平均HER2拷貝數(shù)／細(xì)胞≥6.0為擴(kuò)增。擴(kuò)增細(xì)胞應(yīng)均質(zhì)、連續(xù)，且占浸潤(rùn)癌的10％以上。平均HER拷貝數(shù)／細(xì)胞在4～6之間為不確定。若眾多HER2信號(hào)連接成簇時(shí)可不計(jì)數(shù)，直接視為基因擴(kuò)增。對(duì)于ISH結(jié)果不確定的病例．需要再計(jì)算20個(gè)細(xì)胞核中的信號(hào)或由另外一位分析者重新計(jì)數(shù)。如仍為臨界值，則應(yīng)行IHC檢測(cè)(若FISH前未行)，也可以選取不同的組織塊重新檢測(cè)。建議在HER2 FISH檢測(cè)報(bào)告中包括如下內(nèi)容：患者信息(包括姓名、性別、年齡、門診／住院號(hào))、送檢醫(yī)師姓名、送檢日期、標(biāo)本信息(包括病理號(hào)和蠟塊號(hào))、標(biāo)本部位和類型、探針信息、檢測(cè)方法、是否使用圖像分析、對(duì)照設(shè)置情況、樣本量是否適合評(píng)估、判讀結(jié)果(包括評(píng)估的細(xì)胞數(shù)量、平均HER2拷貝數(shù)／細(xì)胞、平均CEPl7拷貝數(shù)／細(xì)胞、平均HER2拷貝數(shù)／平均CEPl7拷貝數(shù)的比值)、檢測(cè)結(jié)論(如陽(yáng)性、不確定、陰性、無(wú)法判讀)。

3．質(zhì)量控制：(1)內(nèi)對(duì)照：使用上述同時(shí)含有HER2基因和CEPl7序列的混合探針時(shí)，組織中≥75％的細(xì)胞核顯示出雙色信號(hào)時(shí)視為雜交成功，并且雙色信號(hào)互為對(duì)照，癌與非癌細(xì)胞互為對(duì)照。出現(xiàn)下列情況時(shí)應(yīng)視為FISH檢測(cè)失敗，包括：①對(duì)照樣本未出現(xiàn)預(yù)期結(jié)果；②浸潤(rùn)癌病灶太小，難以觀察到兩個(gè)浸潤(rùn)癌區(qū)域并計(jì)數(shù)；③可計(jì)數(shù)信號(hào)的細(xì)胞<75％；④>10％的熒光信號(hào)位于細(xì)胞核外；⑤細(xì)胞核結(jié)構(gòu)難以分辨；⑥有強(qiáng)的自發(fā)熒光。(2)外對(duì)照：應(yīng)選擇已知FISH陽(yáng)性和陰性的標(biāo)本片(或采用廠家提供的對(duì)照片)作為外對(duì)照，且雜交染色結(jié)果與預(yù)期相符。(3)如有可能，建議設(shè)置低擴(kuò)增對(duì)照。

4．關(guān)于第17號(hào)染色體數(shù)目：FISH雙探針檢測(cè)中加入CEPl7探針的目的是為了在檢測(cè)HER2基因的同時(shí)檢測(cè)第17號(hào)染色體數(shù)目，從而將第17號(hào)染色體的非整倍體和單純的HER2基因擴(kuò)增，尤其是低水平的擴(kuò)增區(qū)分開(kāi)。但近年來(lái)的研究顯示整條第17號(hào)染色體的多體罕見(jiàn)，CEP17的多體并不能代表整條第17號(hào)染色體多體。部分乳腺癌中第17號(hào)染色體存在HER2基因和著絲粒的共同擴(kuò)增。越來(lái)越多的學(xué)者認(rèn)為，與HER2／CEPl7比值相比，HER2拷貝數(shù)對(duì)于HER2基因擴(kuò)增的判斷更為重要。因此在HER2 FISH檢測(cè)結(jié)果中除報(bào)告HER2／CEPl7比值外，還應(yīng)分別報(bào)告HER2拷貝數(shù)和CEPl7的數(shù)值。

5．關(guān)于HER2基因的異質(zhì)性：浸潤(rùn)性乳腺癌中HER2表達(dá)或擴(kuò)增可存在異質(zhì)性。雖然HER2基因異質(zhì)性的臨床意義目前仍不明確，但它可導(dǎo)致IHC與ISH檢測(cè)、原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶、穿刺標(biāo)本與手術(shù)切除標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果不一致。在ISH計(jì)數(shù)之前，應(yīng)觀察整張切片或使用IHC確定可能存在HER2擴(kuò)增的區(qū)域。需要強(qiáng)調(diào)的是，即使存在異質(zhì)性，但只要擴(kuò)增細(xì)胞連續(xù)、均質(zhì)，且占浸潤(rùn)癌10％以上，就應(yīng)明確報(bào)告為ISH陽(yáng)性?？裳a(bǔ)充報(bào)告不同細(xì)胞群(>10％)的計(jì)數(shù)值(包括計(jì)數(shù)的細(xì)胞總數(shù)、HER2拷貝數(shù)、CEPl7數(shù)值、HER2／CEPl7比值)，并報(bào)告擴(kuò)增細(xì)胞群占所有浸潤(rùn)癌細(xì)胞的比例。