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前言

宿主細胞蛋白 (Host Cell Protein, HCP) 是細胞生長和后續(xù)生產(chǎn)工藝中來源于宿主細胞系的生物藥品雜質(zhì)，會對藥品最終的安全性和有效性產(chǎn)生不利影響。因此，必須通過一系列純化步驟去除這些 HCP。國際人用藥品注冊技術(shù)協(xié)調(diào)會(ICH)、美國食品和藥物管理局 (U.S. FDA)、歐洲藥品管理局 (EMA) 和其他國家的監(jiān)管機構(gòu)都有關(guān)于 HCP 監(jiān)測的指南。

在本文的研究中，我們對三個來自于下游生產(chǎn)工藝不同純化階段的樣品進行了基于LC-MS高分辨質(zhì)譜串聯(lián)平臺的定性及定量分析，并對每個樣品中存在的高風險HCP進行了特別標注。分析流程請見圖1。

圖1 實驗整體流程

在經(jīng)過一步ProteinA純化后的樣品中，鑒定到676個具有定量信息的HCP（peptide≥3,下同）；再經(jīng)過一步陰離子交換色譜（AEX）純化后，HCP數(shù)目下降至111；在此基礎(chǔ)上再進行一步陽離子交換色譜（CEX）純化后，僅檢測到7個HCP。三個樣品中定性及定量的HCP數(shù)目請見表1。

表1 不同純化階段樣品中定性并定量的HCP，所有數(shù)據(jù)均為三次生物重復(fù)的平均值

對于會引起免疫響應(yīng)、降解蛋白或輔料的高風險HCP是科學家們在產(chǎn)品工藝的優(yōu)化過程中尤為注意的。圖2展示了隨著純化步驟的增多，高風險HCP數(shù)目呈減少趨勢。圖3展示了經(jīng)過三步純化后依然能夠鑒定到的三個高風險HCP及其各自的含量。

圖2. 不同樣品中高風險HCP數(shù)目變化趨勢

圖3. 經(jīng)過三步純化后樣品中依然能鑒定到的高風險HCP

本實驗中所有數(shù)據(jù)均是由一站式生物制藥分析軟件BioPharma Finder4.1處理。該軟件內(nèi)置HCP分析功能，可同時對目標蛋白和HCP進行搜庫、定性和定量（圖4~6）。

圖4 HCP鑒定結(jié)果展示界面

圖5 同一個HCP在不同樣品中的變化趨勢，每個樣品均進行了三針技術(shù)重復(fù)

圖6 三步純化后一條來源于高風險HCP肽段的二級譜圖及覆蓋率

客戶得益

用非變性酶解條件進行 HCP 鑒定和相對定量的工作流程，然后進行 LC-MS/MS 分析。

使用 UHPLC 系統(tǒng)和高分辨率精確質(zhì)量 (HRAM) 質(zhì)譜儀在寬動態(tài)范圍內(nèi)進行HCP定性與相對定量，靈敏度可低至約 1ppm。

為各個 HCP 提供定性和定量信息，可用于指導下游工藝開發(fā)和優(yōu)化決策。

證明 POROS 樹脂具有高選擇性，可有效去除不同含量和種類的 HCP。

Biopharma Finder 4.1單一軟件解決方案，可同時提供目標蛋白的肽圖分析結(jié)果及HCP的定性定量結(jié)果。
 

本研究中使用的樣品由賽默飛生物工藝部下屬的生物工藝設(shè)計中心（Bioprocess Design Center, BDC）所提供。該中心總監(jiān)馬駿表示，近年來，有關(guān)抗體藥品中的HCP可能導致臨床不良反應(yīng)的報道屢見不鮮，其中某些高風險HCP被發(fā)現(xiàn)可能是導致不良反應(yīng)的主要因素。這些案例從客觀上對我們提出了一個新要求：在抗體藥物的CMC開發(fā)過程中，越早對HCP進行更進一步的分析鑒別，越快在工藝開發(fā)中去除高風險HCP，就越有利于該藥品在臨床階段的成功，而LC-MS聯(lián)用的方法無疑為這一需求提供了可靠的工具。