液相色譜儀的工作原理是儲液器中的流動相被高壓泵打入系統(tǒng)，樣品溶液經(jīng)進(jìn)樣器進(jìn)入流動相，被流動相載入色譜柱內(nèi)，由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數(shù)，在兩相中作相對運(yùn)動時(shí),經(jīng)過反復(fù)多次的吸附-解吸的分配過程，各組分在移動速度上產(chǎn)生較大的差別，被分離成單個(gè)組分依次從柱內(nèi)流出，液相色譜儀通過檢測器時(shí)，樣品濃度被轉(zhuǎn)換成電信號傳送到記錄儀，數(shù)據(jù)以圖譜形式打印出來。

    液相色譜儀的使用方法的具體步驟

    1、色譜柱它包括空柱和填料?？罩莾?nèi)壁拋光的不銹鋼管，內(nèi)徑為4～5mm，長100～250mm。按氣相色譜法中洗滌空柱的方法洗凈，用勻漿法填充固定相。將此柱裝入儀器的管路中，用柱式機(jī)械往復(fù)泵輸入新鮮脫氣的流動相。等基線平直后可用苯、萘、菲的混合試液，用正己烷或甲醇：水為流動相測定柱效及分離度塔板數(shù)在2～3萬/ml以上及分離度在1.5以上者，柱效好。

    為防止柱污染，常用1個(gè) 50mm長，4~5mm內(nèi)徑，裝有硅膠或立柱相同填料的保護(hù)柱接在主柱之前，以延長色譜柱的壽命。反相鍵合相柱用畢。必須用水充分流經(jīng)，以洗去鹽類、酸堿等雜質(zhì)防止柱生銹及填料中雜質(zhì)的積聚，再用甲醇流經(jīng)洗滌使色譜柱獲得再生。

    2、流動相的洗脫方式配好經(jīng)脫氣的流動相放于貯液瓶中，經(jīng)過有濾過頭、內(nèi)徑2mm的聚四氟乙烯管流入高壓泵進(jìn)入色譜柱，zui后自檢測器流出或收集或作廢液回收。用流動相洗脫的方式有恒溶劑脫洗法，即自洗脫開始到結(jié)束，溶劑的配比恒定。

    另一類為梯度洗脫法,即使溶劑的極性強(qiáng)度在色譜過程中逐漸增加。須按一定程序不斷改變流動相的濃度配比，從而使同一個(gè)試樣中組分性質(zhì)相差較小的及較大的都能在一次色譜過程中很好分離，而整個(gè)色譜過程縮短。必須注意，梯度洗脫法不能用于分子排阻色譜及用電化學(xué)檢測的反相液相色譜法中。

    3、檢測器適用于血藥濃度的檢測器有紫外線吸收，熒光發(fā)射和電化學(xué)三種。紫外檢測器應(yīng)用于對紫外光有吸收的藥物，大多數(shù)藥物分子對紫外光有吸收，故能較普遍采用，檢測限有0.1μg左右。液相色譜儀有固定波長型、可變波長型及掃描器，既能使流動相停流作組分的定性定量檢測，又能提高測定靈敏度，重現(xiàn)性較好。熒光發(fā)射檢測器對能產(chǎn)生熒光的藥物才能使用。

    光強(qiáng)度增加了3~4倍，對某些藥物的檢測限可達(dá)pg級。電化學(xué)檢測器是由一個(gè)碳糊或破碳做成的蒲層電解池。常用于檢測兒茶酚胺類及有酚類基團(tuán)的各種藥物和代謝物。流出組分進(jìn)入2μl的薄層電解池，在一暄電壓下電解產(chǎn)生電流，放大后檢測，檢測限pg級。

    4、數(shù)據(jù)處理現(xiàn)代液相色譜儀帶有數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，除記錄譜外，還能自動記錄峰的保留時(shí)間，能自動積分求算峰面積，并能按照預(yù)定的程序作有關(guān)計(jì)算，報(bào)告分析結(jié)果。