凍干（冷凍干燥）中的預凍保存和低溫損傷是兩個密切相關的核心問題，直接影響凍干產品的質量和活性保留。以下從機制、問題及解決方案角度進行詳細解釋：

1. 預凍保存（Pre-freezing）

目的與機制

預凍是凍干的第一步，通過將樣品快速降溫至共晶點以下（通常-40℃以下），使樣品中的自由水凍結為冰晶，同時避免在后續(xù)升華階段因液態(tài)水殘留導致結構塌陷。預凍的核心目標是：

- 形成穩(wěn)定冰晶結構：為后續(xù)升華提供均勻的傳質通道。

- 保護活性物質：通過玻璃化（vitrification）減少冰晶對生物大分子（如蛋白質、細胞）的物理損傷。

- 抑制化學降解：低溫下降低酶活性及氧化反應速率。

關鍵參數

- 降溫速率：

 - 快速冷卻（如液氮速凍）：形成小冰晶，減少機械損傷，但可能導致細胞內水未滲出，引發(fā)“胞內冰晶損傷"。

 - 緩慢冷卻：允許水分逐漸遷移至細胞外凍結，減少胞內冰晶，但可能增加溶質濃縮損傷。

- 終點溫度：需低于樣品的共晶點（通常-40~-50℃），確保固化。

- 保護劑（凍干賦形劑）：如蔗糖、海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）等，可提高玻璃化轉變溫度（Tg'），穩(wěn)定生物分子結構。

2. 低溫損傷（Cryoinjury）

低溫損傷是預凍過程中因冰晶形成、溶質濃縮或相變導致的樣品活性損失，主要機制包括：

（1）冰晶機械損傷

- 細胞內冰晶：快速冷卻時，胞內水未及時滲出，形成尖銳冰晶刺破細胞膜。

- 細胞外冰晶：緩慢冷卻時，胞外冰晶擠壓細胞，導致膜破裂。

（2）溶質效應（Solution Effect）

- 水分凍結后，未凍結的液相中溶質（鹽、緩沖液等）濃度急劇升高，導致：

 - pH偏移：破壞蛋白質等生物分子的穩(wěn)定性。

 - 滲透壓失衡：細胞脫水收縮（胞內溶質外流）或膨脹破裂（復水時）。

（3）冷休克（Cold Shock）

- 脂質膜在低溫下發(fā)生相變（液態(tài)→凝膠態(tài)），膜流動性下降，通透性改變。

（4）玻璃態(tài)破裂

- 若預凍未達到玻璃化（部分區(qū)域存在液態(tài)水），在升溫或干燥過程中可能發(fā)生反玻璃化（devitrification），導致冰晶重結晶。

3. 解決方案與優(yōu)化策略

（1）預凍工藝優(yōu)化

- 控制降溫速率：

 - 對細胞（如紅細胞、干細胞）：慢速冷卻（0.1~1℃/min）結合保護劑，減少胞內冰晶。

 - 對蛋白質、疫苗：快速冷卻（如液氮噴淋）結合高濃度保護劑，實現玻璃化。

- 退火（Annealing）：在預凍后短暫升溫至略低于共晶點，使小冰晶重排為大冰晶，減少升華阻力。

- 保護劑篩選：

 - 糖類（海藻糖、蔗糖）：替代水分子與生物分子形成氫鍵，維持結構。

 - 聚合物（PVP、BSA）：抑制冰晶生長，提高Tg'。

（2）低溫損傷緩解

- 滲透保護：添加滲透性保護劑（如甘油、DMSO），平衡胞內外滲透壓。

- 冰晶成核控制：添加冰核蛋白（如AFP）或納米顆粒，誘導均質成核，減小冰晶尺寸。

- 避免溶質濃縮：優(yōu)化緩沖液濃度（如使用低鹽配方），或替換易結晶的緩沖鹽（如磷酸鹽→ Tris）。

4. 應用實例

- 生物醫(yī)藥：疫苗凍干中，預凍需快速形成玻璃態(tài)以保護病毒衣殼蛋白；使用海藻糖作為保護劑可顯著提高穩(wěn)定性。

- 食品工業(yè)：果蔬凍干時，預凍速率過慢會導致細胞壁塌陷，影響復水性；退火處理可改善冰晶結構。

總結

預凍保存與低溫損傷的平衡是凍干工藝設計的核心挑戰(zhàn)。通過調控降溫速率、保護劑配方及退火工藝，可最大限度減少低溫損傷，確保凍干產品的高活性回收率。實際應用中需根據樣品特性（細胞、蛋白質、食品等）進行個性化優(yōu)化。