免疫熒光概述
我們在細胞成像領域深耕近50年，可為您提供值得信賴的研究工具和方案，幫助您實驗即可獲取高品質的細胞圖像。Invitrogen™成像試劑和抗體經過廣泛驗證，享有認可度，且在已發(fā)表研究中被頻繁引用。
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無論您是剛開始進行細胞成像，或者已經富有經驗，都可使用以下經過驗證的五步法流程，確保輕松獲取發(fā)表級細胞圖像。
五步法高品質固定細胞成像
遵照如下5個步驟采集盡可能的固定細胞圖像，即使您第一次使用也可獲得可供發(fā)表的高品質細胞圖像。
步驟一：細胞和組織樣品處理
準備熒光標記的細胞樣品
為實現(xiàn)最佳的圖像質量，首先應建立針對目的蛋白和細胞結構的研究，同時將其他一切背景等排除在圖像之外。固定和破膜細胞樣品用于標記 – 首先將細胞結構、蛋白和核酸固定，然后使熒光染料和抗體滲入到細胞內部，標記目的靶點。封閉細胞樣品，防止熒光標記物與研究無關的蛋白非特異性結合，最大限度提高信噪比。
固定液將細胞結構鎖定。
透化作用可去除細胞膜脂質 - 使標記和檢測試劑能夠穿過膜孔到達細胞內部。
蛋白封閉液有助于減少非特異染色。抗體能夠取代封閉蛋白與其表位形成高親和力結合，而封閉液可防止樣品中的低親和力結合。
在固定和破膜之后，使用NucBlue活細胞染料及ActinGreen 488 ReadyProbes即用型試劑對U2OS細胞進行染色。圖A采用傳統(tǒng)甲醇溶液方法固定，圖B則采用基于甲醛優(yōu)化配方的Image-iT固定/透化試劑盒固定。對比可發(fā)現(xiàn)，圖A中甲醇固定的方法可導致肌動蛋白細胞骨架斷裂和細胞破碎，而Image-iT 固定/透化試劑盒則可為絕大多數(shù)細胞類型提供最佳固定條件。
步驟二：標記樣品
使用細胞器特異性染料、探針和一抗檢測細胞結構和蛋白
通過不同顏色熒光標記不同的靶標，可以直觀的觀察同一樣品細胞內不同結構和蛋白。熒光標記靶標的方法主要包括熒光染料、免疫標記、熒光融合蛋白等——這幾種方法均可選擇性標記細胞內的結構和蛋白，讓您在成像時更輕松地進行觀察。細胞生物學采用的很多熒光工具基本上都是熒光基團。這些熒光基團經過不同的方法修飾或結合到不同的分子上，從而具備了某些的功能與特定的細胞器或蛋白結合。通過化學修飾，單個熒光基團可以產生許多變體形式，且每種變體都有不同的特異性。例如，發(fā)出綠色熒光的Invitrogen Alexa Fluor 488染料分子經過修飾后，可以靶向肌動蛋白微絲，可以結合IgG用于免疫標記，還可用作全細胞染料。Invitrogen提供了超過51000種高品質一抗，其中的部分抗體可以直接結合大量明亮的熒光染料和標記物，包括Invitrogen Alexa Fluor染料系列。
免疫熒光標記推薦產品
Invitrogen提供了100,000多種高質量的一抗，覆蓋85%以上的蛋白靶點。其中涵蓋一些抗體直標熒光標記物和標簽產品，包括Invitrogen的Alexa Fluor染料。
單個熒光基團可以進行任意數(shù)量的標記，包括用于標記細胞結構成分的功能化形式，例如（A）肌動蛋白、（B）微管蛋白和（C）Hydrazide全細胞標記。
采用Invitrogen Image-iT 固定/透化試劑盒制備染色用的培養(yǎng)細胞，然后采用Invitrogen BlockAid封閉液處理。先采用能識別線粒體的一抗標記樣品，然后與Alexa Fluor 750 染料標記的二抗 （紫色），Invitrogen NucBlue細胞核染料（藍色） 和Invitrogen ActinGreen 488即用型試劑（綠色）孵育。在Invitrogen EVOS FL全自動細胞成像系統(tǒng)上采集圖像。
步驟三：檢測樣品
優(yōu)化熒光信號，保證免疫熒光結果
檢測復雜的生物學結構需要最高清晰度的熒光信號，并將熒光信號從背景噪聲中分離開來。標準的免疫熒光標記很少能夠獲得最佳信噪比的成像效果。獲得良好圖片的可供發(fā)表的高質量圖像之間的差異就在于：需要精細調整樣品信號達到峰值特異性、高清晰度和最佳放大倍數(shù)。
固定和破膜HeLa細胞，采用Image-iT固定/透化試劑盒之中的試劑處理，與抗微管蛋白一抗及Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG (H+L) 二抗一同孵育。然后將細胞與抗ATP 合成酶亞型 IF1 抗體一同孵育，并采用Alexa Fluor 594 Tyramide SuperBoost 試劑盒（山羊抗小鼠IgG 和 Alexa Fluor 594酪胺）中的試劑進行標記。用NucBlue 可固定細胞即用型染料標記細胞核。采用共聚焦顯微鏡采集圖像。
中等至高豐度的蛋白靶標
二抗可用于間接檢測目的抗原。一抗與靶標直接結合，而二抗則以一抗為橋梁，間接結合目標生物分子。這種方法可以放大信號，提高靈敏度，最大限度的檢測出靶標。
一抗（橙色和黃色）與靶表位結合后，熒光標記的二抗（紫色和藍色）結合特異性的一抗。
中等至低豐度的蛋白靶標
鏈霉親和素結合物可以提高標記靶標的熒光基團的數(shù)量，從而放大信號?；阪溍褂H和素信號放大技術廣泛應用于熒光成像，用以提高一抗和二抗檢測的靈敏度。
使用熒光基團-鏈霉親和素標記的抗體可以增強信號，因為更多的熒光基團可以與單個抗體分子結合，從而放大信號。
低豐度蛋白靶標
對于傳統(tǒng)方法無法檢測到的低豐度蛋白靶標，酪胺信號放大技術(TSA)可以在不降低分辨率的前提下，進行靈敏的檢測。TSA技術采用了一種能在過氧化氫存在的條件下釋放活性染料的酶，從而使靶標明顯且清晰的與背景區(qū)分開。
酪胺信號放大技術在不影響分辨率的情況下獲取優(yōu)質的靈敏度。
免疫熒光檢測推薦產品
與Alexa Fluor染料相比，Alexa Fluor Plus二抗采用專有的技術，信噪比高達4.2倍，為檢測低豐度靶標提供了更高的靈敏度。
Invitrogen Tyramide SuperBoost試劑盒采用 Invitrogen SuperBoost 技術，為低豐度蛋白靶標提供免疫熒光檢測方法。SuperBoost試劑盒的靈敏度是標準免疫化學（ICC）、免疫組織化學（IHC）和原位雜交（ISH）方法的10-200倍，可為低豐度靶標的高分辨成像提供優(yōu)質的信號放大、定義和清晰度。SuperBoost試劑將Alexa Fluor染料的亮度與值得信賴的poly-HRP酪胺信號放大技術結合，使靈敏度比標準處理方法高2-10倍，包括其他供應商的試劑。
步驟四：保護樣品
避免熒光信號發(fā)生光漂白，提高免疫熒光圖像質量
雖然熒光基團是進行高質量細胞成像，但不可避免地也極易發(fā)生光漂白，即熒光信號的光化學降解或衰退。任何光敏感度的下降都可能導致數(shù)據(jù)出現(xiàn)偏差，產生假性結果。抗淬滅封片劑可以保護熒光標記蛋白的穩(wěn)定性，維持數(shù)周乃至數(shù)月的圖像信號完整度。
推薦產品
Invitrogen ProLong Glass抗淬滅封片劑的設計旨在為整個可見和近紅外光譜內提供抗淬滅保護。ProLong Glass封片劑的折射率為1.52，可與多種熒光染料一起用于幾乎所有細胞以及深度范圍為0.1 µm至150 µm的組織樣品，獲得明亮、高分辨率的Z-stack、3D和2D圖像。由于減少了圖像失真，其在油鏡和共聚焦顯微鏡下也能很好地工作。
ProLong抗淬滅封片劑用于固定細胞成像具有以下好處：
· 即使在長時間儲存后，仍可以在整個光譜范圍內抑制光漂白
· 在整個光譜范圍內的背景都很低
· 固化封片劑
· 可選含有或不含DAPI兩種形式
· 即用型隨取隨用優(yōu)化配方
· 可根據(jù)您的需求選擇折射率：ProLong Glass試劑為1.52，ProLong Diamond和ProLong Gold試劑為1.47
60秒延時成像顯示，使用ProLong抗淬滅封片劑能夠提高對光漂白的抵抗性。使用FITC鬼筆環(huán)肽標記固定的HeLa細胞，并使用ProLong Glass試劑、ProLong Diamond試劑、ProLong Gold試劑或50% PBS/甘油封片。在使用標準100瓦汞弧燈連續(xù)照明的條件下，使用20倍物鏡以12秒間隔采集圖像。
步驟五：樣品成像
保證您的免疫熒光結果具有分辨率和清晰度
通過采集最高清晰度圖像突破研究新發(fā)現(xiàn)。在當今激烈的科研競爭環(huán)境下，能否快速獲得可供發(fā)表的高質量圖像是決定您成敗的關鍵。想要獲取最頂級的圖像，就需要配備頂級成像元件的成像平臺，包括：
· 高性相機和光學元件，快速采集高分辨率圖像
· 全新一代LED光立方，擁有信噪比表現(xiàn)
· 功能強大的圖像采集和分析軟件，輕松采集發(fā)表級的圖像數(shù)據(jù)
免疫熒光成像推薦產品
選擇簡單易用的模塊化系統(tǒng)，可以根據(jù)您的實驗需求進行調整。我們提供可定制的20多種Invitrogen EVOS LED光立方、容器支架和物鏡等，涵蓋廣泛的熒光激發(fā)和發(fā)射光譜。
需要在提高樣品通量的同時獲取更多定量數(shù)據(jù)？Celllnsight CX5高內涵篩選平臺提供自動圖像采集與同步數(shù)據(jù)分析，讓您在5分鐘內分析多達50萬個表型細胞。
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