（一）什么是3d懸浮細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，定義？

3D懸浮細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)是一種先進(jìn)的體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，其核心在于無需固體支架或基質(zhì)附著，直接在動態(tài)懸浮的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。在該系統(tǒng)中，細(xì)胞通過自組裝或特定培養(yǎng)條件（如微載體、低粘附表面、旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器、懸滴法、磁懸浮，北京基爾比生物科技公司研制生產(chǎn)的3d懸浮細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)系統(tǒng)等）形成三維（3D）聚集體、球狀體（Spheroids）或類器官（Organoids）。與傳統(tǒng)單層（2D）貼壁培養(yǎng)相比，它還原了細(xì)胞在活體組織中的三維空間結(jié)構(gòu)、細(xì)胞間相互作用以及微環(huán)境信號，是構(gòu)建更接近生理狀態(tài)的體外模型的革命性技術(shù)。

1.  模擬體內(nèi)三維微環(huán)境與細(xì)胞間相互作用：

   細(xì)胞在三維空間中自由生長、遷移和相互作用，形成復(fù)雜的細(xì)胞-細(xì)胞連接和細(xì)胞外基質(zhì)網(wǎng)絡(luò)。這種結(jié)構(gòu)直接影響細(xì)胞的基因表達(dá)、信號傳導(dǎo)、分化和功能，使其行為（如增殖、代謝、藥物反應(yīng)）更接近體內(nèi)真實(shí)情況。

2.  支持復(fù)雜組織結(jié)構(gòu)形成與功能表達(dá)：

    系統(tǒng)能促進(jìn)細(xì)胞自組織形成具有空間異質(zhì)性的結(jié)構(gòu)，如腫瘤球體（模擬實(shí)體瘤的缺氧核心和增殖外層）、肝細(xì)胞球體（形成類似膽管的結(jié)構(gòu)）、神經(jīng)球（形成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)）以及高度復(fù)雜的類器官（如迷你腸、腎、腦等）。這些結(jié)構(gòu)能更好地展現(xiàn)源組織的特定功能（如藥物代謝、屏障功能、電信號傳導(dǎo)）。

3.  提供動態(tài)培養(yǎng)環(huán)境：

    通過攪拌、旋轉(zhuǎn)或灌注等方式，例如北京基爾比生物科技公司研制生產(chǎn)的3d懸浮細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)對培養(yǎng)基的持續(xù)混合，確保營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣的均勻分布，并及時清除代謝廢物。這種動態(tài)環(huán)境比靜態(tài)培養(yǎng)更能模擬體內(nèi)的流體剪切力和物質(zhì)交換，尤其適用于模擬血管化組織或研究流體力學(xué)對細(xì)胞的影響（如內(nèi)皮細(xì)胞）。

4.  實(shí)現(xiàn)高通量篩選與分析：

    形成的3D球狀體或小聚集體大小相對均一，非常適合在微孔板中進(jìn)行自動化操作和高通量應(yīng)用，如藥物篩選、毒性測試、基因功能研究。其生理相關(guān)性遠(yuǎn)高于2D模型，能提供更可靠的預(yù)測數(shù)據(jù)。

5.  適用于規(guī)?；囵B(yǎng)與特定細(xì)胞類型：

    懸浮培養(yǎng)模式易于在Kirkstall Quasi Vivo 3D活細(xì)胞自動灌注動態(tài)構(gòu)建培養(yǎng)系統(tǒng)中放大規(guī)模，用于生產(chǎn)細(xì)胞治療產(chǎn)品（如干細(xì)胞、免疫細(xì)胞）或生物制品（如病毒、重組蛋白）。尤其適合本身在體內(nèi)就是懸浮生長的細(xì)胞（如血液細(xì)胞、某些腫瘤細(xì)胞）或難以貼壁的細(xì)胞（如多能干細(xì)胞）。

北京基爾比生物科技公司研制生產(chǎn)的【3D懸浮細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)】通過提供無支架的三維動態(tài)環(huán)境，核心功能在于突破性地模擬體內(nèi)組織的復(fù)雜結(jié)構(gòu)與微環(huán)境，使體外培養(yǎng)的細(xì)胞展現(xiàn)出更真實(shí)的生理和病理行為。它在基礎(chǔ)研究（發(fā)育、疾病機(jī)制）、藥物研發(fā)（高通量篩選、毒性預(yù)測、個性化醫(yī)療）、再生醫(yī)學(xué)（類器官、細(xì)胞治療）等領(lǐng)域正迅速成為的強(qiáng)大工具，顯著提升體外模型的預(yù)測價值和生理相關(guān)性。

（二）北京基爾比生物公司三維懸浮細(xì)胞培養(yǎng)案例

通過3D懸浮微培養(yǎng)技術(shù)，將成年患者的皮膚成纖維細(xì)胞直接重編程為功能性神經(jīng)元，并展示了這些神經(jīng)元在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中的穩(wěn)定性和功能性。這項(xiàng)技術(shù)為神經(jīng)退行性疾病的細(xì)胞替代療法和疾病建模提供了新的可能性。

試驗(yàn)步驟

細(xì)胞準(zhǔn)備

從皮膚活檢中獲取成年皮膚成纖維細(xì)胞（hDFs），并進(jìn)行培養(yǎng)。

- hDFs培養(yǎng)于T175培養(yǎng)瓶中，使用未涂覆的培養(yǎng)瓶以避免細(xì)胞貼壁。

- 細(xì)胞在37°C、5% CO?下培養(yǎng)。

細(xì)胞傳代

當(dāng)細(xì)胞達(dá)到90%匯合時，使用0.05%胰蛋白酶在D-PBS中傳代。

- 傳代比例根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求調(diào)整。

- 傳代后的細(xì)胞可用于后續(xù)的重編程實(shí)驗(yàn)或冷凍保存。

細(xì)胞重編程準(zhǔn)備

將hDFs重懸于含有慢病毒的培養(yǎng)基中，準(zhǔn)備進(jìn)行3D培養(yǎng)。

- 使用超低吸附表面的錐形微孔板（如Elplasia板或Costar U型底微孔板）。

- 根據(jù)所需細(xì)胞球大小選擇合適的微孔板。

3D細(xì)胞球形成

將細(xì)胞與慢病毒混合后，接種到微孔板中，通過離心使細(xì)胞均勻分布于微孔中。

- 離心條件：24小時，100g。

- 細(xì)胞在24小時內(nèi)自組裝成球形結(jié)構(gòu)。

細(xì)胞球培養(yǎng)

在特定的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞球，促進(jìn)成纖維細(xì)胞向神經(jīng)元的轉(zhuǎn)化。

- 培養(yǎng)基：NDiff227，補(bǔ)充以下成分：早期神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基（第0-16天） CHIR99021：2 μM SB431542：10 μM Noggin：0.5 μg/ml LDN1931189：0.5 μM VPA：1 mM LM22A4：2 μM GDNF：2 ng/ml NT3：10 ng/ml db-cAMP：0.5 mM 晚期神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基（第16天后） LM22A4：2 μM GDNF：2 ng/ml NT3：10 ng/ml db-cAMP：0.5 mM

- 細(xì)胞球在培養(yǎng)期間保持空間分離，避免融合。

細(xì)胞球收獲與移植

在培養(yǎng)一定時間后，輕輕收獲細(xì)胞球，用于移植或其他實(shí)驗(yàn)。

- 使用玻璃毛細(xì)管進(jìn)行移植，確保細(xì)胞球的完整性。

- 移植時避免對細(xì)胞球進(jìn)行酶解或機(jī)械分離。

功能驗(yàn)證

對重編程后的神經(jīng)元進(jìn)行功能驗(yàn)證，包括電生理記錄、鈣成像和多巴胺釋放檢測。

- 電生理記錄：使用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，記錄細(xì)胞的動作電位和離子電流。

- 電生理記錄和鈣成像實(shí)驗(yàn)在培養(yǎng)60天后進(jìn)行。

體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)

將3D培養(yǎng)的神經(jīng)元移植到成年大鼠的大腦中，評估其存活、成熟和功能整合。

- 移植部位：大鼠背外側(cè)紋狀體。

- 移植的細(xì)胞球大小為2000細(xì)胞/球，使用150 μm內(nèi)徑的玻璃毛細(xì)管進(jìn)行移植。

關(guān)鍵結(jié)論

• 3D培養(yǎng)的優(yōu)勢：3D懸浮培養(yǎng)技術(shù)提供了一個有利于神經(jīng)元轉(zhuǎn)化和長期存活的環(huán)境，克服了2D培養(yǎng)中細(xì)胞附著和機(jī)械應(yīng)激的問題。

• 功能性神經(jīng)元的生成：通過3D培養(yǎng)技術(shù)，研究者能夠生成具有功能性突觸和神經(jīng)遞質(zhì)釋放能力的神經(jīng)元。

• 體內(nèi)移植的成功：3D培養(yǎng)的神經(jīng)元在移植到成年大鼠大腦后能夠存活、成熟并整合到宿主神經(jīng)回路中，這為未來的細(xì)胞替代療法提供了希望。

• 疾病建模和再生醫(yī)學(xué)的應(yīng)用潛力：這種3D培養(yǎng)技術(shù)為研究神經(jīng)退行性疾病和開發(fā)新的治療方法提供了新的工具。

北京基爾比生物科技公司的【3d懸浮微重力細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)】的優(yōu)勢在于多功能集成與實(shí)時監(jiān)控能力。設(shè)備內(nèi)置傳感器，可實(shí)時監(jiān)控并可視化重力水平；旋轉(zhuǎn)器主體緊湊設(shè)計可放入標(biāo)準(zhǔn)CO2培養(yǎng)箱，維持細(xì)胞培養(yǎng)的溫濕度和氣體環(huán)境。

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