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用恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)大鼠海馬神經元原代細胞
神經元培養(yǎng)的portocol，是較難培養(yǎng)的一種細胞。關鍵就是大鼠年齡的選擇，是胎鼠，新生鼠還是成年大鼠，理想的是胎鼠。今天喆圖小編就從這個說起，用恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)大鼠海馬神經元原代細胞的幾種培養(yǎng)的方法。
1.海馬分離：剖宮產取出胚胎，放在保存液中移至顯微鏡下操作取出胎腦，去掉小腦，從中線切開左右大腦半球。剝去軟腦膜以及脈絡叢血管。然后鈍性分離海馬，顯微鏡下用剪刀剪下海馬即可
2. 組織消化和計數(shù)：每個取出的海馬組織都放置在含有4℃培養(yǎng)液的試管中?？焖俜蛛x數(shù)個胎鼠海馬后就可以做消化和細胞計數(shù)了。消化液用經典的胰蛋白酶于恒溫培養(yǎng)箱中 37℃恒溫 30分鐘即可。然后吹打(1000ul tip 10-20次，2ml 灼燒拉伸的玻璃管，口徑與200ul tip相當，吹打10-20次)到看不到組織為止。很多protocol建議此刻離心。消化后去上清，留1-2ml直接吹打，然后就可以直接細胞計數(shù)。
3. 分盤培養(yǎng)：神經元會長的很大，所以密度要低，50000/ml就可以了，100mm的plate, 5-7ml。培養(yǎng)液用無血清無抗生素加B27和N2的DMEM效果就很好。培養(yǎng)皿要用PDL和含血清以及抗生素的培養(yǎng)液預處理72小時。這樣可以避免感染也讓神經元容易附著和分化。每一周加1-2ml的新鮮培養(yǎng)液，于恒溫培養(yǎng)箱中37℃恒溫，2-3周即可成熟。
4.染色檢測：后就是標記蛋白檢測，一般可用MAP2標記神經纖維，一些神經遞質受體標記突觸，NeuN標記神經元細胞核。
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