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中級(jí)會(huì)員 | 第2年

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鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)氨酶(nithine-δ-aminotransferase ,δ-OAT)試劑盒說(shuō)明書(shū)

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鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)氨酶(nithine-δ-aminotransferase ,δ-OAT)試劑盒說(shuō)明書(shū)

分光光度法 50 /48 

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義:

脯氨酸是植物體內(nèi)適應(yīng)逆境脅迫的一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。高等植物中脯氨酸代謝因其初始底物不同,分為谷an( Glu) 和鳥(niǎo)氨酸( Orn) 兩條合成途徑。鳥(niǎo)an酸轉(zhuǎn)氨酶( δ-OAT) 是以鳥(niǎo)an酸為前體合成an酸途徑的關(guān)鍵酶,對(duì)植物適應(yīng)逆境脅迫起關(guān)鍵作用。

測(cè)定原理:

鳥(niǎo)氨酸和α-酮戊二酸在鳥(niǎo)an酸轉(zhuǎn)氨酶和 NADH 作用下發(fā)生氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)生成吡咯啉-5-羧酸(P5C),同時(shí)產(chǎn)生NAD,通過(guò)檢測(cè) 340nm 處的吸光度的變化可反映鳥(niǎo)an酸轉(zhuǎn)氨酶活性的高低。

組成:

 

產(chǎn)品名稱(chēng)

BH6015-50T/48S

Storage

提取液:液體

55ml

4

試劑一:液體

70ml

4

試劑二:粉劑

1 

4

試劑三:粉劑

1 

4

試劑四:粉劑

2 

-20

說(shuō)明書(shū)

1

 

試劑二臨用前加 20ml 試劑一充分溶解;用不完的試劑 4℃保存。試劑三臨用前加 20ml 試劑一充分溶解;用不完的試劑 4℃保存。試劑四臨用前每瓶加 10ml 試劑一充分溶解;現(xiàn)配現(xiàn)用。

自備儀器和用品:

天平、低溫離心機(jī)、研缽、紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、1ml 石英比色皿。

酶液提?。?/span>

1、組織:按照質(zhì)量(g):提取液體積(ml) 15~10 的比例(建議稱(chēng)取約 0.1g,加入 1ml 提取液)加入提取液,冰浴勻漿后于 4℃,10000g 離心 10min,取上清置冰上待測(cè)。

2、細(xì)胞:按照細(xì)胞數(shù)量(104 個(gè)):提取液體積(ml 500~10001 的比例(建議 500 萬(wàn)細(xì)胞加入1ml 提取液),冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率 300w,超聲 3 秒,間隔 7 秒,總時(shí)間 3min;然后 4℃,10000g離心 10min,取上清置冰上待測(cè)。

3、液體:直接檢測(cè)。

測(cè)定操作:

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 340nm

2、將配好的試劑二、三、四 37℃預(yù)熱 5min。(注意:粉劑試劑需要自行配制

3、取 1ml 石英比色皿,依次加入 300μl 試劑二,300μl 試劑三,300μl 試劑四,100μl 粗酶液,充分混勻,記錄 340nm 處初始吸光值和 37℃反應(yīng) 10min 的吸光值A2,A=A1-A2

計(jì)算公式:

(1) 按照樣本蛋白濃度計(jì)算

酶活單位定義:每毫克組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。 δ-OATnmol/min /mg prot=ΔA÷(ε×d×V 反總÷(V ×Cpr) ÷T

=160.77×ΔA÷Cpr

(2) 按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活單位定義:每克組織每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。 δ-OATnmol/min /g 鮮重)=ΔA÷(ε×d×V 反總÷(W ×V ÷V 樣總) ÷T

=160.77×ΔA÷W

 

(3) 按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活單位定義:每 104 個(gè)細(xì)胞每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。 δ-OATnmol/min /104 cell= ΔA÷(ε×d×V 反總÷(V ×細(xì)胞數(shù)量÷V 樣總) ÷T

=160.77×ΔA÷細(xì)胞數(shù)量

(4) 按照液體體積計(jì)算

酶活單位定義:每毫升液體每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。 δ-OATnmol/min /ml)=ΔA÷(ε×d×V 反總÷V ÷T

=160.77×ΔA

V 反總:反應(yīng)體系總體積,1ml;ε:NADH 摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cmd:比色皿光徑,1cm V 樣:加入樣本體積,0.1ml;V 樣總:加入提取液體積,1ml;T:反應(yīng)時(shí)間,10 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/ml;W:樣本質(zhì)量,g


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