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1、cell counting：盡量做到準(zhǔn)確，會(huì)影響input結(jié)果。

 

2、cross link：甲醛的終濃度是1%，這個(gè)基本所有的protocol上都會(huì)強(qiáng)調(diào)。

 

3、resuspend cellswith SDS:一定要選用小的tip頭，在液面下吹打，否則很容易產(chǎn)生氣泡，后面的sonication就麻煩了。

 

4、sonication：ChIP中zui重要的一部分，合適的條件要自己摸索，可以一次嘗試不同次數(shù)的sonication，然后建議采用EZ-ChIP上推薦的方法看看sonication的效果如何。

 

5、加入salmon spermDNA/Protein A or G之前要先混勻，因?yàn)閟almon sperm DNA是很粘稠的物質(zhì)，若不混勻，后面你會(huì)發(fā)現(xiàn)beads的量不一樣，自然也會(huì)影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。

 

6、wash 的時(shí)候前面幾個(gè)步驟可以不用洗的太干凈，但zui后一個(gè)要盡量吸干凈，必要時(shí)可用gel loading tips吸。

 

7、含beads的samples離心時(shí)，有的protocol上推薦是1000rpm，45秒，但可以根據(jù)情況調(diào)整，但要注意轉(zhuǎn)速不能太快防止beads破碎。（當(dāng)然如果采用的是magnetic的beads就不存在這個(gè)問題）

 

8、reverse crosslink可以是65°4個(gè)小時(shí)，也可以overnight。

 

9、reverse crosslink后的在進(jìn)行下面步驟之前建議先離心，把蒸發(fā)到離心管蓋子上的部分離下來(lái)。

 

10、每次行real time PCR之前都要把sample離心保證取樣的準(zhǔn)確。

 

11、1~10ul的槍取3ul以上才比較準(zhǔn)確，所以考慮好自己PCR反應(yīng)體系的配置。

 

12、一個(gè)ChIP一般需要3~4天的時(shí)間，其中有幾個(gè)步驟是可以停下來(lái)的：

 

（1）細(xì)胞收集：用含蛋白酶抑制劑的PBS洗滌離心，去上清的細(xì)胞收集液可置-80°凍存；

 

（2）用SDS重懸細(xì)胞后可置-80°凍存；

 

（3）sonication結(jié)束，離心后的上清置新的離心管后可-80°凍存；

 

（4）reverse cross-link后的標(biāo)本可-80°凍存。

 

13、agarose beads 的wash過程中以及后面的DNA提取過程中乙醇的wash，可以用細(xì)胞室的那種吸引器，接上200ul的tip頭吸，這樣會(huì)節(jié)省很多時(shí)間（每個(gè)實(shí)驗(yàn)室情況可能不一樣）。

 

14、DNA提取后建議用水溶解DNA，因?yàn)門E buffer里的EDTA可能會(huì)影響PCR反應(yīng)體系中的Mg2+。

 

15、溶解DNA的水量可以根據(jù)PCR反應(yīng)體系的要求適當(dāng)調(diào)整。