土壤植酸酶（phytase）試劑盒說(shuō)明書
微量法100T/48S
注 意 ：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
測(cè)定意義：
植酸酶（phytase）是催化植酸及其鹽類水解為肌醇與磷酸（鹽）的一類酶的總稱，屬磷酸單酯水解酶，它能將食品和飼料中植酸及其鹽轉(zhuǎn)化為可供有機(jī)體利用的有效磷，降低糞便中的磷含量，減輕對(duì)環(huán)境的污染，改善營(yíng)養(yǎng)成分的吸收和利用，因此具有極其廣泛的研究和應(yīng)用價(jià)值。
測(cè)定原理：
植酸酶在一定溫度和pH值條件下，水解底物植酸鈉生成無(wú)機(jī)磷與肌醇衍生物，無(wú)機(jī)磷在酸性環(huán)境中與鉬酸銨顯色劑反應(yīng)生成藍(lán)色復(fù)合物，在700nm處有特征吸收峰，根據(jù)700nm處吸光值變化可計(jì)算得植酸酶活性。
自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：
天平、低溫離心機(jī)、酶標(biāo)儀、96孔板、恒溫水浴鍋，甲苯（不允許快遞）。
試劑的組成和配制：
緩沖液：液體60mL×1瓶，4℃保存。
試劑一：粉劑×1瓶，4℃避光保存，臨用前加緩沖液30mL配制，現(xiàn)用現(xiàn)配；用不完的試劑4℃保存一個(gè)月。
試劑二：液體15mL×1瓶，4℃保存。
顯色劑：粉劑×6管，4℃避光保存，臨用前根據(jù)用量每瓶加0.4mL雙蒸水溶解，再加1.6mL試劑二混勻。
樣本處理：
新鮮土樣自然風(fēng)干或37度烘箱風(fēng)干，過(guò)30~50目篩。
測(cè)定操作表：
對(duì)照管 | 測(cè)定管 | |
樣本（g） | 0.03 | 0.03 |
甲苯 | 20 | 20 |
振蕩混勻，室溫放置15min | ||
緩沖液（µL） | 500 | |
試劑一（µL） | 500 | |
混勻，37℃孵育24h，10000g，4℃離心5min，取上清 | ||
上清 | 100 | 100 |
顯色劑（µL） | 100 | 100 |
混勻，靜置15min，測(cè)定700nm處吸光值，△A=A測(cè)定管-A對(duì)照管。每個(gè)測(cè)定管設(shè)一個(gè)對(duì)照管。 | ||
酶活性計(jì)算公式：
標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 0.8795x + 0.0084，R2 = 0.9977；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μmol/mL），y為吸光值△A。
酶活性定義：在37℃，pH5.5的條件下，每克土樣每小時(shí)從5mmol/L的植酸鈉溶液中釋放出1μmol的無(wú)機(jī)磷為一個(gè)酶活力單位。
植酸酶活性（μmol/h /g 土樣）=（△A-0.0084）÷0.8795×V反總÷W÷T
=0.82×（△A-0.0084）
V反總：反應(yīng)總體積，0.52mL；T：反應(yīng)時(shí)間，24h；W：樣本質(zhì)量，0.03g。
注意事項(xiàng)：
1、顯色劑需要臨用前根據(jù)用量配制，每一瓶是10個(gè)樣本的用量，新配制的顯色劑若有顏色則已經(jīng)污染或者試劑過(guò)期，應(yīng)放棄使用。
2、ΔA線性范圍為0.01-0.5。
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