應(yīng)用文集｜完整蛋白質(zhì)和亞基純度“柱”力提高生物制藥關(guān)鍵質(zhì)量屬性

時間：2022-11-23 閱讀：698

反相色譜仍然是色譜工作者“武器庫"中最有價值的工具之一。這是一種廣為人知的技術(shù)，依賴于分析物和固定相之間的疏水相互作用。對于完整蛋白質(zhì)，該技術(shù)使用有機溶劑梯度作為流動相，通常使用離子對試劑。在這些條件下，分子很可能發(fā)生變性。這是一種靈敏的分析技術(shù)，因為樣品保留在色譜柱上得到濃縮，且適用于質(zhì)譜分析。因此，該技術(shù)適用于測定完整蛋白質(zhì)的精確質(zhì)量。

對于大分子蛋白質(zhì)（例如單克隆抗體），甚至對于較小的片段（例如重鏈和輕鏈或 IgG 分子的 Fab 和 Fc 區(qū)域），推薦使用大孔徑色譜柱。安捷倫能夠提供多種配置的 300 ? 和 450 ? 產(chǎn)品，包括全多孔、采用表面多孔顆粒的 Poroshell 技術(shù)以及一系列烷基鍵合相。鍵合相通常具有較短的碳鏈長度（C8 或 C4/C3）或具有更多獨特的配體，例如可提供不同選擇性的二苯基。由于反相色譜分析準確度高，因此可以使用完整蛋白質(zhì)和片段分析來比較生物治療藥物的生物仿制藥與原研藥。然而，始終需要執(zhí)行額外的測試以鑒定可能檢出的不同異構(gòu)體的具體位置。

色譜柱選擇

選擇用于完整蛋白質(zhì)分析的反相色譜柱時需要考慮多個相互關(guān)聯(lián)的因素：樣品分子量和最適合的填料孔徑，色譜柱固定相，所用的儀器（特別是檢測器的類型），流動相條件，以及速度或通量要求等。

分析物分子越大，則需要越大的孔徑。除一些例外情況，用于完整蛋白質(zhì)分析的孔徑通常為 300–500 ?。根據(jù)經(jīng)驗，孔徑至少應(yīng)為蛋白質(zhì)流體動力學半徑的三倍。AdvanceBio RP-mAb 色譜柱具有 450 ? 的孔徑，ZORBAX RRHD 300 ?、ZORBAX 300SB 和 Poroshell 300 均具有 300 ? 的孔徑，而 PLRP-S 提供多種孔徑。雖然 1000 ? 的 5 µm PLRP-S 色譜柱孔徑明顯大于常用于完整蛋白質(zhì)分析的色譜柱，但是該色譜柱可為完整蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)片段分析提供優(yōu)異的結(jié)果。

對于反相色譜柱，選擇色譜柱固定相的通用指南是，分子量越大，使用的烷基鏈應(yīng)越短。因此，C18 色譜柱常用于多肽分析，而 C8、C4 和 C3 色譜柱常用于完整蛋白質(zhì)分離。除線性烷基鏈以外，AdvanceBio RP-mAb、ZORBAX RRHD 300 和 ZORBAX 300SB 色譜柱可提供二苯基固定相。有時，二苯基固定相的不同選擇性可提供所需的分離。PLRP-S 是一種聚合物填料而不是硅膠基填料。它提供典型的反相分離以及略有不同的選擇性和寬 pH 耐受性。