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淺析熒光素標(biāo)記的生物素操作步驟
(一)獲得目的基因
1、通過(guò)PCR方法：以含目的基因的克隆質(zhì)粒為模板，按基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物(在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點(diǎn))，PCR循環(huán)獲得所需基因片段。
2、通過(guò)RT-PCR方法：用TRIzol法從細(xì)胞或組織中提取總RNA，以mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA第一鏈，以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR循環(huán)獲得產(chǎn)物。
(二)構(gòu)建重組表達(dá)載體
1、熒光素標(biāo)記的生物素載體酶切：將表達(dá)質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶(同引物的酶切位點(diǎn))進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物行瓊脂糖電泳后，用膠回收Kit或凍融法回收載體大片段。
2、PCR產(chǎn)物雙酶切后回收，在T4DNA連接酶作用下連接入載體。
(三)獲得含重組表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)菌種
1、將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，根據(jù)重組載體的標(biāo)志(抗Amp或藍(lán)白斑)作篩選，挑取單斑，堿裂解法小量抽提質(zhì)粒，雙酶切初步鑒定。
2、測(cè)序驗(yàn)證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確，進(jìn)入下步操作。否則應(yīng)篩選更多克隆，重復(fù)亞克隆或亞克隆至不同酶切位點(diǎn)。
3、以此重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌的感受態(tài)細(xì)胞。
(四)誘導(dǎo)表達(dá)
1、熒光素標(biāo)記的生物素挑取含重組質(zhì)粒的菌體單斑至2mlLB(含Amp50μg/ml)中37℃過(guò)夜培養(yǎng)。
2、按1∶50比例稀釋過(guò)夜菌，一般將1ml菌加入到含50mlLB培養(yǎng)基的300ml培養(yǎng)瓶中，37℃震蕩培養(yǎng)至OD600≌0.4-1.0(*0.6，大約需3hr)。
3、取部分液體作為未誘導(dǎo)的對(duì)照組，余下的加入IPTG誘導(dǎo)劑至終濃度0.4mM作為實(shí)驗(yàn)組，兩組繼續(xù)37℃震蕩培養(yǎng)3hr。
4、分別取菌體1ml，離心12000g×30s收獲沉淀，用100μl1%SDS重懸，混勻，70℃10min。
5、離心12000g×1min，取上清作為樣品，可做SDS-PAGE等分析。