PriCells: 從組織和培養(yǎng)細胞中制備輕線粒體組分

試劑和器材： 
1. 勻漿介質(zhì)：0.25mol/L蔗糖溶液、1mmol/L乙二胺四乙酸、10mmol/L Hepes-NaOH，pH7.4；
2. 按要求向溶液加入蛋白酶抑制劑；
3. 磷酸鹽緩沖液；
4. 低速冷凍離心機，配有30—40ml離心管的吊桶式離心轉(zhuǎn)子；
5. 高速離心機，配有30—40ml離心管的固定角轉(zhuǎn)子；
6. 用于肝臟：Potter-Elvehjem（聚四氟乙烯樹脂和玻璃）勻漿器（30—40ml），連接高轉(zhuǎn)矩橋式電動機（半導(dǎo)體開關(guān)控制）；
7. 用于細胞：滾珠軸承勻漿器或帶23號或25號針頭的注射器；
8. Dounce勻漿器（寬松配制，Wheaton B型）；
9. 20ml規(guī)格注射器（內(nèi)徑約0.8mm），帶金屬套管針；

實驗方法：
   所有操作須在0—4℃下進行。
1. 對肝臟：用剪刀非常細微地剪碎組織（或使用組織切碎機），用勻漿介質(zhì)轉(zhuǎn)移到Potter-Elvehjem勻漿器中（每2.5g組織使用10ml介質(zhì)）。研杵研磨6次左右進行勻漿（500—700r/min）；
2. 對細胞：在5ml磷酸鹽緩沖液中洗滌（1—3）×108個細胞，再換用勻漿介質(zhì)進行洗滌。在3ml勻漿介質(zhì)中混懸細胞，在滾珠軸承勻漿器中來回5次勻漿；
3. 800g下離心10min，沉淀核、細胞碎屑和未破碎細胞；
4. 傾倒或吸?。ㄊ褂冕樄芎妥⑸淦鳎┥锨澹糜诒?；
5. 在寬松配制Dounce勻漿器中研杵研磨2—3次進行勻漿，使用10ml勻漿介質(zhì)重懸沉淀（細胞則使用5ml）；
6. 重復(fù)離心，合并上清；
7. 將合并的上清在3000g下離心10min；
8. 將第7步得到的上清在15000g下離心10min；
9. 用10ml（細胞對應(yīng)5ml）勻漿介質(zhì)重懸輕線粒體沉淀，在寬松配制Dounce勻漿器中用研杵輕輕地研磨2—3次；
10. 15000g下離心10min；
11. 在適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)中重懸沉淀用于分析或進一步處理；