PriCells: 利用Hoechst 33342外流性質(zhì)分選原代角膜間質(zhì)干細(xì)胞

試劑和材料：
1. 2—4代的間質(zhì)細(xì)胞；
2. HBSS/2FB；
3. Hoechst 33342染料，1mg/ml水溶；
4. 碘化丙啶（PI），2mg/ml水溶；
5. 維拉帕米，500μg/ml水溶；
6. DEME/2FB；
7. 胰蛋白酶/TrypLE：TrypLE Express或0.25%胰蛋白酶，溶于CMF-Saline G；
8. MoFlo（或與其類似的）高速細(xì)胞分選儀，具備350nm激發(fā)能力；

實(shí)驗(yàn)方法：
1. 用PriCells原代細(xì)胞分離試劑盒2—4代的間質(zhì)細(xì)胞；
2. 細(xì)胞計(jì)數(shù)，用DMEM/2FB將細(xì)胞稀釋至1×10⁶/cm2個(gè)細(xì)胞/ml；
3. 加入5μg/ml Hoechst 33342染料，37℃，90min，每20min攪動(dòng)一次；
4. 對(duì)照組細(xì)胞在加入Hoechst 33342染料前，先加入50μg/ml維拉帕米孵育20min；
5. 染色后，在4℃環(huán)境下用HBSS/2FB將細(xì)胞洗兩遍并離心，之后在冰上用冷HBSS/2FB重懸細(xì)胞；
6. 于分選前加入2μg/ml PI以鑒別無(wú)活性的細(xì)胞；
7. 無(wú)菌條件下分選細(xì)胞，高速細(xì)胞分選儀，用350nm激發(fā)。收集藍(lán)色（670nm）和紅色（450nm）熒光均減弱的細(xì)胞。邊群細(xì)胞通過(guò)上述步驟與死細(xì)胞和*被染料標(biāo)記的細(xì)胞分離開(kāi)并被收集起來(lái)。對(duì)照組要確保用維拉帕米先行孵育后使邊群細(xì)胞消失；