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PriCells: 正常人角膜上皮細(xì)胞和干細(xì)胞的分離

時(shí)間:2021-10-21 閱讀:209
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PriCells: 正常人角膜上皮細(xì)胞和干細(xì)胞的分離


實(shí)驗(yàn)材料:
1. 完整的人角膜;
2. GMF-Saline G;
3. 中性蛋白酶Ⅱ,1.2U/ml(用DMEM/F12/GASP稀釋2.4U中性蛋白酶Ⅱ);
4. 胰蛋白酶/EDTA;
5. DMEM/F12/GASP;
6. DEME/F12/2FB/GASP:DMEM/F12/GASP含2%FBS;
7. CMF/GASP;
8. LSC培養(yǎng)基;
9. 彎虹膜剪,11cm(4-3/8in);
10. Jeweler’s鑷,10cm(4in);
11. 角膜剪,19mm刃,尖頭;
12. Colibri縫紉鉗,0.1mm;

實(shí)驗(yàn)方法:
1. 清洗角膜3×5min;
2. 剪除殘留的鞏膜,結(jié)膜和虹膜;
3. 加入2ml中性蛋白酶Ⅱ,4℃過夜,輕微攪動(dòng);
4. 將加入中性蛋白酶Ⅱ的角膜放入4℃搖床搖30min;
5. 用DMEM/F12/GASP清洗角膜;
6. 解剖顯微鏡下,小心去除角膜中央的上皮細(xì)胞(此時(shí)多數(shù)的中央上皮細(xì)胞已經(jīng)剝脫)并除去角膜緣包含有Vogt柵欄區(qū)的色素上皮細(xì)胞;
7. 用胰蛋白酶/EDTA消化角膜緣上皮細(xì)胞片37℃,10min;
8. 加入等體積DMEM/F12/2FB/GASP;
9. 400g離心10min,棄上清;
10. 用DMEM/F12/2FB/GASP洗一遍,離心,棄上清;
11. 加入LSC培養(yǎng)基,將細(xì)胞拍散并用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù);
12. 將細(xì)胞以1×104/cm2的密度接種至鋪有3T3飼養(yǎng)層的組織培養(yǎng)皿或準(zhǔn)備好的人羊膜上;
13. 每三天更換一次培養(yǎng)基;
14. 當(dāng)細(xì)胞達(dá)90%匯合時(shí)用胰蛋白酶消化傳代:


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